| 摘要 | 第6-8页 |
| ABSTRACT | 第8-9页 |
| 英文缩略词表 | 第16-19页 |
| 第一章 文献综述 | 第19-36页 |
| 1.1 胸腺肽β4研究进展 | 第19-25页 |
| 1.1.1 胸腺肽β4的简介 | 第19-20页 |
| 1.1.2 Tβ4生物学功能 | 第20-21页 |
| 1.1.2.1 Tβ4促进细胞迁移和粘附 | 第20页 |
| 1.1.2.2 Tβ4促进血管再生、细胞分化和肿瘤转移 | 第20-21页 |
| 1.1.2.3 Tβ4防止细胞凋亡,促进细胞生存和组织再生 | 第21页 |
| 1.1.2.4 Tβ4降低炎症反应,抑制发炎细胞的游动和粘附 | 第21页 |
| 1.1.2.5 Tβ4刺激毛囊发育 | 第21页 |
| 1.1.3 毒理学研究 | 第21-23页 |
| 1.1.4 临床应用 | 第23-25页 |
| 1.1.4.1 皮肤伤口的治愈和修复 | 第23页 |
| 1.1.4.2 眼角膜伤口的治愈和修复 | 第23-24页 |
| 1.1.4.3 心脏疾病 | 第24页 |
| 1.1.4.4 中枢神经系统疾病 | 第24页 |
| 1.1.4.5 呼吸系统疾病/囊性纤维化 | 第24-25页 |
| 1.2 植物生物反应器研究进展 | 第25-33页 |
| 1.2.1 植物生物反应器的特点 | 第25-26页 |
| 1.2.2 植物植物转化战略 | 第26-28页 |
| 1.2.2.1 稳定核转化 | 第26页 |
| 1.2.2.2 稳定的质体转化 | 第26页 |
| 1.2.2.3 植物细胞悬浮培养 | 第26-27页 |
| 1.2.2.4 瞬时表达系统 | 第27-28页 |
| 1.2.3 植物表达系统缺陷及改进策略 | 第28-31页 |
| 1.2.3.1 低产量问题 | 第28-30页 |
| 1.2.3.2 糖基化 | 第30页 |
| 1.2.3.3 下游加工的成本 | 第30-31页 |
| 1.2.4 植物性重组蛋白 | 第31-33页 |
| 1.2.4.1 植物性疫苗抗原 | 第31-32页 |
| 1.2.4.2 植物源性抗体 | 第32页 |
| 1.2.4.3 治疗性和保健性蛋白质 | 第32-33页 |
| 1.2.4.4 商用蛋白 | 第33页 |
| 1.3 植物生物反应器生产Tβ4研究展望 | 第33-34页 |
| 1.4 本研究理论依据和理论科学意义 | 第34-35页 |
| 1.5 技术路线 | 第35-36页 |
| 第二章 用大肠杆菌(ESCHERICHIA COLI)表达4×TB4 | 第36-70页 |
| 2.1 实验材料 | 第36-39页 |
| 2.1.1 菌株和载体 | 第36-37页 |
| 2.1.2 主要仪器设备 | 第37-38页 |
| 2.1.3 试剂及试剂盒 | 第38-39页 |
| 2.1.3.1 酶与试剂盒 | 第38页 |
| 2.1.3.2 激素、抗生素与培养基 | 第38页 |
| 2.1.3.3 抗体、标品与分子量标记 | 第38-39页 |
| 2.1.3.4 其它试剂 | 第39页 |
| 2.2 方法 | 第39-51页 |
| 2.2.1 原核表达载体的构建 | 第39-44页 |
| 2.2.1.1 pET-28a质粒制备 | 第39-40页 |
| 2.2.1.2 用BamHI和SacⅠ酶切pET-28a质粒 | 第40页 |
| 2.2.1.3 目的片段纯化回收 | 第40页 |
| 2.2.1.4 目的基因合成 | 第40-41页 |
| 2.2.1.5 4×Tβ4构建 | 第41页 |
| 2.2.1.6 pMD18-6×His-4×Tβ4载体构建 | 第41页 |
| 2.2.1.7 目的基因4×Tβ4的获得 | 第41页 |
| 2.2.1.8 目的片段的连接 | 第41-42页 |
| 2.2.1.9 大肠杆菌(DH5α)感受态细胞的制备和连接反应物的转化 | 第42-43页 |
| 2.2.1.9.1 大肠杆菌感受态细胞制备(CaCl_2法) | 第42-43页 |
| 2.2.1.9.2 连接反应产物转化大肠杆菌感受态细胞 | 第43页 |
| 2.2.1.10 阳性克隆的筛选及测序鉴定 | 第43-44页 |
| 2.2.2 4×Tβ4在大肠杆菌BL21中进行表达 | 第44-47页 |
| 2.2.2.1 pET28a-6×his-4×Tβ4转化大肠杆菌BL21 | 第44页 |
| 2.2.2.2 目的蛋白的诱导表达 | 第44页 |
| 2.2.2.3 SDS-PAGE电泳检测表达产物 | 第44-45页 |
| 2.2.2.4 Western blot检测 | 第45-46页 |
| 2.2.2.5 目的蛋白的可溶性分析 | 第46-47页 |
| 2.2.2.6 诱导条件的优化 | 第47页 |
| 2.2.3 4×Tβ4蛋白纯化 | 第47-48页 |
| 2.2.4 MTT法检测4×Tβ4生物活性 | 第48-49页 |
| 2.2.5 4×Tβ4融合蛋白在小鼠皮肤创伤愈合过程中的作用 | 第49-51页 |
| 2.2.5.1 创伤皮肤组织的制备 | 第49-50页 |
| 2.2.5.2 病理学实验 | 第50-51页 |
| 2.2.5.2.1 皮肤组织固定与脱水 | 第50页 |
| 2.2.5.2.2 皮肤组织包埋与切片 | 第50页 |
| 2.2.5.2.3 切片苏木精·伊红(HE)染色 | 第50-51页 |
| 2.3 结果 | 第51-68页 |
| 2.3.1 Tβ4合成和DNA测序 | 第51-52页 |
| 2.3.2 4 联体Tβ4(4×Tβ4)构建 | 第52-54页 |
| 2.3.3 大肠杆菌表达载体构建 | 第54-56页 |
| 2.3.4 大肠杆菌诱导表达 | 第56-62页 |
| 2.3.4.1 BL21诱导表达 | 第56-57页 |
| 2.3.4.2 表达产物Western blot分析 | 第57-58页 |
| 2.3.4.3 4×Tβ4蛋白可溶性分析 | 第58-60页 |
| 2.3.4.4 诱导条件优化 | 第60-62页 |
| 2.3.5 重组的4×Tβ4蛋白纯化 | 第62-64页 |
| 2.3.6 4×Tβ4的MTT活性检测 | 第64-65页 |
| 2.3.7 4×Tβ4促进小鼠皮肤创伤的愈合 | 第65-68页 |
| 2.4 讨论 | 第68页 |
| 2.5 小结 | 第68-70页 |
| 第三章 用烟草表达具有生物活性的4×TB4 | 第70-99页 |
| 3.1 材料和方法 | 第70-82页 |
| 3.1.1 植物材料 | 第70页 |
| 3.1.2 载体构建 | 第70-71页 |
| 3.1.2.1 植物表达载体构建 | 第70-71页 |
| 3.1.2.2 植物表达载体35S：：6×His-4×Tβ4的鉴定 | 第71页 |
| 3.1.3 工程农杆菌的制备 | 第71-72页 |
| 3.1.4 烟草无菌苗获得 | 第72页 |
| 3.1.5 农杆菌介导烟草遗传转化 | 第72-73页 |
| 3.1.6 转基因烟草PCR检测 | 第73页 |
| 3.1.7 基因组Southern杂交分析 | 第73-78页 |
| 3.1.7.1 烟草基因组DNA大量抽提和纯化 | 第73-74页 |
| 3.1.7.2 基因组DNA的限制性酶切和凝胶电泳分离 | 第74-75页 |
| 3.1.7.3 Southern bolt转膜印迹与固定 | 第75-76页 |
| 3.1.7.4 探针的制备与标记 | 第76-77页 |
| 3.1.7.5 预杂交和杂交 | 第77页 |
| 3.1.7.6 洗膜 | 第77页 |
| 3.1.7.7 检测 | 第77-78页 |
| 3.1.8 转基因烟草RT-qPCR检测 | 第78-80页 |
| 3.1.8.1 烟草RNA的抽提 | 第78页 |
| 3.1.8.2 cDNA样品准备 | 第78-79页 |
| 3.1.8.3 标准曲线绘制 | 第79页 |
| 3.1.8.4 转基因烟草Real-time PCR分析 | 第79-80页 |
| 3.1.9 重组蛋白表达分析 | 第80-81页 |
| 3.1.9.1 烟草叶片中可溶性蛋白的提取 | 第80页 |
| 3.1.9.2 可溶性蛋白含量的测定 | 第80页 |
| 3.1.9.2.1 标准曲线制作 | 第80页 |
| 3.1.9.2.2 烟草叶片可溶性蛋白含量测定 | 第80页 |
| 3.1.9.2.3 结果统计 | 第80页 |
| 3.1.9.3 Western blot | 第80-81页 |
| 3.1.9.4 ELISA分析 | 第81页 |
| 3.1.10 烟草表达4×Tβ4蛋白生物活性检测 | 第81-82页 |
| 3.1.11 烟草表达4×Tβ4促进小鼠皮肤创伤的愈合 | 第82页 |
| 3.2 研究结果 | 第82-98页 |
| 3.2.0 植物表达载体35S：：6×His-4×Tβ4构建 | 第82-83页 |
| 3.2.1 程农杆菌EHA105制备 | 第83-84页 |
| 3.2.2 烟草遗传转化及再生 | 第84-85页 |
| 3.2.3 转4×Tβ4基因烟草的PCR检测 | 第85-87页 |
| 3.2.4 转基因烟草Southern blotting分析 | 第87页 |
| 3.2.5 转基因烟草Real-time PCR分析 | 第87-89页 |
| 3.2.6 转基因烟草可溶性蛋白提取和测定 | 第89-91页 |
| 3.2.7 转基因烟草可溶性蛋白的SDS-PAGE检测 | 第91-92页 |
| 3.2.8 烟草表达的4×Tβ4的Western Blot检测 | 第92页 |
| 3.2.12 转基因烟草的ELISA检测 | 第92-94页 |
| 3.2.13 4×Tβ4生物活性测定结果 | 第94-95页 |
| 3.2.14 4×Tβ4融合蛋白在小鼠皮肤创伤愈合过程中的作用 | 第95-98页 |
| 3.3 讨论 | 第98-99页 |
| 第四章 总结和展望 | 第99-102页 |
| 4.1 总结 | 第99-100页 |
| 4.1.1 4×Tβ4基因合成及原核表达载体构建 | 第99页 |
| 4.1.2 4×Tβ4的表达 | 第99页 |
| 4.1.3 原核表达4×Tβ4的纯化和鉴定 | 第99页 |
| 4.1.4 转4×Tβ基因烟草的分子检测 | 第99-100页 |
| 4.1.5 4×Tβ4的MTT实验 | 第100页 |
| 4.1.6 4×Tβ4促进创伤愈合 | 第100页 |
| 4.2 后续工作展望 | 第100-102页 |
| 参考文献 | 第102-115页 |
| 附录 实验涉及的试剂和培养基配方 | 第115-120页 |
| 致谢 | 第120-122页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文和申请的专利 | 第122页 |
