| 摘要 | 第5-9页 |
| ABSTRACT | 第9-12页 |
| 第一章 绪论 | 第22-38页 |
| 1.1 S-腺苷蛋氨酸简介 | 第22-23页 |
| 1.1.1 S-腺苷蛋氨酸的理化性质 | 第22页 |
| 1.1.2 S-腺苷蛋氨酸的生理功能 | 第22-23页 |
| 1.2 S-腺苷蛋氨酸的生产方法 | 第23-26页 |
| 1.2.1 酶催化法合成S-腺苷蛋氨酸 | 第23-24页 |
| 1.2.2 全细胞催化法合成S-腺苷蛋氨酸 | 第24页 |
| 1.2.3 微生物发酵法生产S-腺苷蛋氨酸 | 第24-26页 |
| 1.3 S-腺苷蛋氨酸高产菌株的改造 | 第26-29页 |
| 1.3.1 S-腺苷蛋氨酸高产菌株的传统选育 | 第26-27页 |
| 1.3.2 S-腺苷蛋氨酸合成酶的选择及改造 | 第27页 |
| 1.3.3 S-腺苷蛋氨酸合成途径的优化 | 第27-28页 |
| 1.3.4 菌株合成ATP能力的改善 | 第28-29页 |
| 1.4 辅因子调控的研究现状 | 第29-34页 |
| 1.4.1 辅因子工程简介 | 第29页 |
| 1.4.2 辅因子NAD(P)H调控的研究现状 | 第29-31页 |
| 1.4.3 辅因子ATP调控的研究现状 | 第31-34页 |
| 1.5 论文主要研究内容 | 第34-38页 |
| 1.5.1 微生物法制备S-腺苷蛋氨酸存在的问题 | 第34-35页 |
| 1.5.2 辅因子调控S-腺苷蛋氨酸合成过程存在的问题 | 第35页 |
| 1.5.3 主要研究内容 | 第35-38页 |
| 第二章 NADPH调控大肠杆菌合成S-腺苷蛋氨酸的研究 | 第38-76页 |
| 2.1 引言 | 第38-39页 |
| 2.2 实验材料 | 第39-43页 |
| 2.2.1 菌株和质粒 | 第39-41页 |
| 2.2.2 引物 | 第41-43页 |
| 2.2.3 酶及试剂盒 | 第43页 |
| 2.2.4 实验仪器及常用试剂 | 第43页 |
| 2.3 分子生物学操作方法 | 第43-50页 |
| 2.3.1 基因组提取 | 第43-44页 |
| 2.3.2 大肠杆菌质粒提取 | 第44页 |
| 2.3.3 目的基因的扩增 | 第44-45页 |
| 2.3.4 琼脂糖凝胶电泳及DNA回收 | 第45-46页 |
| 2.3.5 酶切及连接 | 第46页 |
| 2.3.6 大肠杆菌的化学转化 | 第46-47页 |
| 2.3.7 菌落PCR | 第47页 |
| 2.3.8 大肠杆菌的电转化 | 第47-48页 |
| 2.3.9 SDS-PAGE电泳 | 第48-49页 |
| 2.3.10 细菌RNA的提取 | 第49页 |
| 2.3.11 cDNA的制备 | 第49-50页 |
| 2.3.12 荧光定量PCR | 第50页 |
| 2.4 发酵方法 | 第50-52页 |
| 2.4.1 菌种保藏 | 第50-51页 |
| 2.4.2 培养条件 | 第51-52页 |
| 2.5 分析方法 | 第52-53页 |
| 2.5.1 生物量测定 | 第52页 |
| 2.5.2 荧光强度测定 | 第52页 |
| 2.5.3 S-腺苷蛋氨酸的萃取及含量测定 | 第52-53页 |
| 2.5.4 谷胱甘肽的提取及含量测定 | 第53页 |
| 2.5.5 其他代谢物测定 | 第53页 |
| 2.5.6 ATP和ADP的含量测定 | 第53页 |
| 2.5.7 NAD(H)和NADP(H)的含量测定 | 第53页 |
| 2.6 实验结果与讨论 | 第53-75页 |
| 2.6.1 基于人工合成sRNA系统的构建 | 第53-57页 |
| 2.6.2 基于人工合成sRNA系统的弱化效果评价 | 第57-60页 |
| 2.6.3 基于人工合成sRNA调控副产物代谢途径相关基因 | 第60-62页 |
| 2.6.4 基于合成sRNA系统调控胞内NADPH水平 | 第62-66页 |
| 2.6.5 NADPH再生系统对S-腺苷蛋氨酸合成的影响 | 第66-69页 |
| 2.6.6 NADPH调控胞内S-腺苷蛋氨酸合成的机理研究 | 第69-75页 |
| 2.7 本章小结 | 第75-76页 |
| 第三章 基于人工合成的sRNA策略及核糖开关ydaO模块调控大肠杆菌胞内ATP水平的研究 | 第76-98页 |
| 3.1 引言 | 第76-77页 |
| 3.2 实验材料与方法 | 第77-80页 |
| 3.2.1 菌株和质粒 | 第77-78页 |
| 3.2.2 引物 | 第78-79页 |
| 3.2.3 枯草芽孢杆菌基因组提取 | 第79页 |
| 3.2.4 磷钼酸比色法测定胞内ATP含量 | 第79-80页 |
| 3.3 结果分析与讨论 | 第80-95页 |
| 3.3.1 ATP依赖的副产物代谢途径相关基因的sRNA弱化系统构建 | 第80-85页 |
| 3.3.2 合成的sRNA系统对于细胞生长和S-腺苷蛋氨酸合成的影响 | 第85-87页 |
| 3.3.3 合成的sRNA策略扰动ATP水平并且重新定向碳代谢分布 | 第87-89页 |
| 3.3.4 ATP水平变化对于谷胱甘肽合成的影响 | 第89页 |
| 3.3.5 ydaO模块动态调控ATP的原理及设计 | 第89-91页 |
| 3.3.6 ydaO模块动态调控ATP相关质粒的构建 | 第91-93页 |
| 3.3.7 ydaO模块在大肠杆菌胞内表达的验证 | 第93-94页 |
| 3.3.8 核糖开关ydaO对于大肠杆菌胞内合成S-腺苷蛋氨酸的调控作用 | 第94-95页 |
| 3.4 本章小结 | 第95-98页 |
| 第四章 酿酒酵母中细胞质和线粒体中NADPH的调控作用 | 第98-114页 |
| 4.1 引言 | 第98-99页 |
| 4.2 实验材料与方法 | 第99-102页 |
| 4.2.1 菌株和质粒 | 第99-100页 |
| 4.2.2 引物 | 第100页 |
| 4.2.3 菌种保藏及培养条件 | 第100-101页 |
| 4.2.4 酿酒酵母的化学转化 | 第101-102页 |
| 4.2.5 重组酿酒酵母菌落PCR | 第102页 |
| 4.3 结果分析与讨论 | 第102-112页 |
| 4.3.1 酿酒酵母不同区域NADPH再生重组质粒的构建 | 第102-104页 |
| 4.3.2 NADPH再生重组菌株的构建 | 第104页 |
| 4.3.3 NADPH再生系统在酿酒酵母细胞中的定位表征 | 第104-106页 |
| 4.3.4 NADPH再生系统对于胞内吡啶核苷酸的扰动 | 第106-109页 |
| 4.3.5 分区域调控NADPH对于S-腺苷蛋氨酸合成的影响 | 第109-110页 |
| 4.3.6 酿酒酵母分区域NADPH调控机理分析 | 第110-112页 |
| 4.4 本章小结 | 第112-114页 |
| 第五章 ATP调控策略用于酿酒酵母合成S-腺苷蛋氨酸的研究 | 第114-142页 |
| 5.1 引言 | 第114-115页 |
| 5.2 实验材料与方法 | 第115-122页 |
| 5.2.1 菌株和质粒 | 第115-116页 |
| 5.2.2 引物 | 第116-118页 |
| 5.2.3 酿酒酵母基因表达盒的快速构建 | 第118-120页 |
| 5.2.4 酿酒酵母RNA的提取 | 第120-121页 |
| 5.2.5 酿酒酵母胞内代谢物的测定 | 第121-122页 |
| 5.3 结果分析与讨论 | 第122-141页 |
| 5.3.1 pRS425-P_(TFEl)-sam2-T_(PGI)重组质粒构建 | 第122-123页 |
| 5.3.2 胞内ATP水平扰动的相关质粒构建 | 第123-125页 |
| 5.3.3 启动子的选择 | 第125-126页 |
| 5.3.4 ATP水平变化对于S-腺苷蛋氨酸合成的影响 | 第126-128页 |
| 5.3.5 酿酒酵母胞内ATP水平变化 | 第128-129页 |
| 5.3.6 ATP调控对于胞内代谢物的分布影响 | 第129-134页 |
| 5.3.7 ATP调控对于中心碳代谢关键基因的转录作用分析 | 第134-138页 |
| 5.3.8 不同蛋氨酸浓度对于S-腺苷蛋氨酸合成的影响 | 第138-141页 |
| 5.4 本章小结 | 第141-142页 |
| 第六章 结论与建议 | 第142-146页 |
| 6.1 论文主要结论 | 第142-143页 |
| 6.2 论文创新点 | 第143-144页 |
| 6.3 问题与展望 | 第144-146页 |
| 参考文献 | 第146-156页 |
| 附录 | 第156-162页 |
| 附录1 试剂盒及分子操作主要试剂 | 第156-157页 |
| 附录2 其他主要试剂 | 第157-158页 |
| 附录3 主要设备 | 第158-159页 |
| 附录4 基因优化序列 | 第159-162页 |
| 研究成果及发表的学术论文 | 第162-164页 |
| 致谢 | 第164-166页 |
| 作者与导师简介 | 第166-167页 |
| 附件 | 第167-168页 |
