| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-9页 |
| 符号说明 | 第9-11页 |
| 第一章 文献综述 | 第11-20页 |
| 一 关于禽大肠杆菌的研究进展 | 第11-17页 |
| 1 禽大肠杆菌概述 | 第11-12页 |
| ·禽大肠杆菌病的临床症状 | 第11页 |
| ·禽致病性大肠杆菌病的流行特点和防治措施 | 第11-12页 |
| 2 大肠杆菌的血清型 | 第12页 |
| 3 禽致病性大肠杆菌的主要毒力因子 | 第12-15页 |
| ·抗血清活性因子 | 第12-13页 |
| ·黏附素(Adhesin) | 第13-14页 |
| ·铁摄取系统 | 第14-15页 |
| ·温度敏感性血凝素(TSH) | 第15页 |
| ·志贺毒素 | 第15页 |
| 4 目的基因的研究背景 | 第15-17页 |
| ·ahpF的研究背景 | 第15-16页 |
| ·yfgC的研究背景 | 第16-17页 |
| 二 两种突变技术的研究进展 | 第17-20页 |
| 1 Red重组技术的研究进展 | 第17-18页 |
| ·Red重组系统的组成 | 第17页 |
| ·Red同源重组相关质粒的介绍 | 第17页 |
| ·Red同源重组系统的发展趋势 | 第17-18页 |
| 2 CRISPR/Cas系统的研究进展 | 第18-20页 |
| ·CRISPR/Cas系统的研究历史 | 第18页 |
| ·CRISPR/Cas的基因座结构 | 第18-19页 |
| ·CRISPR/Cas系统的机制 | 第19页 |
| ·CRISPR/Cas系统构建突变株 | 第19-20页 |
| 第二章 λRed重组和CRISPR/Cas技术在构建禽病原性大肠杆菌ahpF、yfgC基因突变株中的运用 | 第20-50页 |
| 1 材料 | 第20-22页 |
| ·菌株和质粒 | 第20-21页 |
| ·主要试剂 | 第21-22页 |
| ·主要仪器 | 第22页 |
| ·分子生物学及数据分析软件 | 第22页 |
| ·试验动物 | 第22页 |
| 2 用λRed重组系统构建ahpF、yfgC突变株 | 第22-27页 |
| ·质粒pMD-T-ahpF-Cat、pMD-T-yfgC-Cat重组质粒的构建 | 第22-26页 |
| ·E058ΔahpF-1、E058ΔyfgC-1突变株的构建 | 第26-27页 |
| ·突变株抗性基因的去除 | 第27页 |
| 3 用CRISPR/Cas重组系统构建ahpF、yfgC突变株 | 第27-29页 |
| ·gRNA的设计 | 第27-28页 |
| ·CRISPR/Cas突变株的构建 | 第28-29页 |
| ·质粒的消除 | 第29页 |
| 4 突变株生物学特性的研究 | 第29-31页 |
| ·生长曲线的测定 | 第29页 |
| ·SPF鸡血清杀菌试验 | 第29-30页 |
| ·体外竞争试验 | 第30页 |
| ·基因组DNA去除鉴定和cDNA的PCR鉴定 | 第30-31页 |
| 5 突变株的回复拯救实验 | 第31-33页 |
| ·ahpF回复基因片段的扩增 | 第31-32页 |
| ·yfgC回复基因片段的扩增 | 第32页 |
| ·重组质粒pACYC184-ahpF、pACYC184-yfgC的构建 | 第32-33页 |
| ·电转化E058ΔahpF和E058ΔyfgC有抗突变株获得其回复拯救株 | 第33页 |
| 6 突变菌株的致病性实验 | 第33-34页 |
| ·半数致死量(LD_(50))试验 | 第33页 |
| ·体内动态分布试验 | 第33-34页 |
| 7 结果 | 第34-49页 |
| ·质粒pMD-T-ahpF-Cat、pMD-T-yfgC-Cat片段的鉴定结果 | 第34-36页 |
| ·重叠PCR片段的鉴定 | 第36-37页 |
| ·构建的突变株的鉴定 | 第37-39页 |
| ·RT-PCR结果 | 第39-44页 |
| ·突变株的回复拯救结果 | 第44页 |
| ·突变株生物学特性的研究结果 | 第44-49页 |
| 8 讨论 | 第49-50页 |
| 全文总结 | 第50-51页 |
| 参考文献 | 第51-59页 |
| 致谢 | 第59-60页 |
