血管紧张素Ⅱ联合5-氮杂胞苷对小鼠脂肪间充质干细胞向心肌细胞和内皮细胞分化的影响

【摘要】：背景与目的心肌一旦发生梗死,很难通过心肌再生恢复心肌功能。脂肪间充质干细胞(Adipose-derived mesenchymalstemcells, ADMSCs)由于其独特的优势成为细胞心肌成形术中理想的种子细胞。目前对ADMSCs分化为心肌血管内皮细胞的研究较少。本研究利用血管紧张素Ⅱ (AngⅡ)和5-氮杂胞苷(5-aza)联合诱导小鼠ADMSCs向心肌细胞分化的同时,观察对内皮细胞分化的影响,试图为临床上寻找更合理的治疗缺血性心脏病的方法提供实验和理论依据。方法1. ADMSCs的体外分离与培养：取小鼠腹股沟脂肪,利用差速贴壁法进行分离纯化,并进行传代。观察细胞的形态学特点,运用MTT法检测细胞的增殖情况,运用免疫荧光技术检测细胞表面抗原CD90, CD105, CD73, CD45的表达。2.实验分组：将细胞分为4组：(1)对照组：加完全培养基的ADMSCs。 (2)5-aza组：加含有5-aza培养基进行诱导24h,然后更换为完全培养基。(3) AngⅡ组：加含有Ang Ⅱ培养基进行诱导24h,然后更换为完全培养基。(4)联合诱导组：加入含有5-aza和AngⅡ的培养基诱导24h,然后更换为完全培养基。3.光镜下观察经诱导后的细胞形态学特点。运用免疫荧光鉴定CD31,cTnT的表达,运用Western blot检测cTnT蛋白含量。结果1.形态学特点：原代ADMSCs胞核较小,形态多样,短梭形,椭圆形、不规则形,胞体两端有长、短不一的突出。第3代的细胞体积增大,形态趋于一致,排列规则。经5-aza诱导后的细胞形态多样化,有短杆状、不规则形状,部分包膜不清晰,胞质中出现空泡；经AngⅡ及联合培养组诱导的细胞,增殖速度较快,细胞形态均匀,包膜清晰,分泌基质较多,呈集团状聚集,部分细胞形成环状分布。2.MTT法结果显示：ADMSCs生长曲线呈“S”形,第1-3天为细胞生长潜伏期,第4天开始进入对数生长期,第7天达高峰期。3.免疫荧光检测结果：第3代ADMSCs表面CD90、CD105、CD73阳性表达,CD45阴性表达。AngⅡ组,联合诱导组均能表达CD31。-5-aza组、AngⅡ组,联合诱导组均能表达cTnT。4. Western blotting结果：5-aza组、AngⅡ组,联合诱导组均能表达cTnT,且联合诱导组的cTnT蛋白表达量最高。结论1.5-aza和AngⅡ在体外均能够诱导ADMSCs分化为心肌细胞,两者联合可提高ADMSCs向心肌细胞分化的分化率。2.AngⅡ可以诱导ADMSCs分化为内皮细胞,且能促进细胞增殖。
【关键词】：5-aza AngⅡ 心肌细胞 内皮细胞 脂肪间充质于细胞
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R541