| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-10页 |
| 1 绪论 | 第10-18页 |
| ·谷胱甘肽概述 | 第10页 |
| ·自然界中的谷胱甘肽合成酶 | 第10-12页 |
| ·谷胱甘肽合成酶在细菌中的表达特点 | 第10-11页 |
| ·谷胱甘肽合成酶在动物中的表达特点 | 第11页 |
| ·谷胱甘肽合成酶在植物中的表达特点 | 第11-12页 |
| ·拟南芥和烟草中GSHI的序列比对 | 第12页 |
| ·谷胱甘肽合成酶在代谢中的作用 | 第12-13页 |
| ·GSH体内生物合成的两步反应 | 第12-13页 |
| ·谷胱甘肽在自然和胁迫条件下的代谢过程 | 第13页 |
| ·植物抗寒研究进展 | 第13-18页 |
| ·酶系统多态性与植物抗寒性 | 第14-15页 |
| ·抗寒基因的表达和调控与植物抗寒性 | 第15-16页 |
| ·抗寒基因的诱导因素 | 第16-17页 |
| ·植物抗寒分子机理发展的展望 | 第17-18页 |
| 2 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSHI)表达载体的构建 | 第18-30页 |
| ·植物材料 | 第18页 |
| ·Trizol试剂提取总RNA | 第18-19页 |
| ·实验准备 | 第18页 |
| ·实验程序 | 第18页 |
| ·RNA质量检测 | 第18-19页 |
| ·反转录实验步骤 | 第19页 |
| ·PCR扩增拟南芥GSHI基因 | 第19-21页 |
| ·拟南芥GSHI基因的克隆及测序 | 第21-27页 |
| ·酶切鉴定pGEM- GSHI载体 | 第22页 |
| ·构建表达载体 | 第22-25页 |
| ·目的载体(GSHI-pETM20)转化表达菌株高效表达 | 第25-26页 |
| ·纯化目的蛋白 | 第26-27页 |
| ·相关实验方法 | 第27-29页 |
| ·电转化大肠杆菌 | 第27-28页 |
| ·碱裂解法提质粒 | 第28页 |
| ·试剂盒进行胶回收步骤 | 第28-29页 |
| ·本章小结 | 第29-30页 |
| 3 双元载体成功表达实例 | 第30-38页 |
| ·大肠杆菌总DNA提取 | 第30-31页 |
| ·基于pET28a的特殊引物设计 | 第31-33页 |
| ·pET28a-himA载体的构建 | 第33页 |
| ·pGEM-himD载体的构建 | 第33-34页 |
| ·目的载体转化DH5a后的菌落PCR结果 | 第34-35页 |
| ·目的载体的酶切鉴定 | 第35-36页 |
| ·IHF表达 | 第36-37页 |
| ·本章小结 | 第37-38页 |
| 4 实时荧光PCR监测烟草谷胱甘肽合成酶(T-GSHI)在温度胁迫下的抗逆作用 | 第38-51页 |
| ·荧光定量PCR技术发展史 | 第38页 |
| ·荧光定量PCR概念 | 第38页 |
| ·荧光定量PCR与普通PCR的主要区别 | 第38-39页 |
| ·荧光定量PCR的方法 | 第39-41页 |
| ·非特异性SYBR Green I染料法 | 第39-41页 |
| ·特异性Taqman水解探针法 | 第41页 |
| ·绝对定量分析 | 第41-42页 |
| ·绝对定量分析方法的使用条件 | 第41页 |
| ·引物和探针的设计 | 第41-42页 |
| ·相对定量分析 | 第42-44页 |
| ·相对定量分析方法的使用条件 | 第42页 |
| ·相对定量数据处理方法 | 第42-43页 |
| ·实验结果与数据处理 | 第43-44页 |
| ·植物材料的培养 | 第44页 |
| ·实验设计 | 第44-45页 |
| ·探针制备 | 第45-46页 |
| ·T-GSHI荧光定量PCR引物(T-GSHI-RP)设计与合成 | 第45页 |
| ·内参18sRNA荧光定量PCR引物设计与合成 | 第45-46页 |
| ·TRIZOL提取植物总RNA | 第46页 |
| ·实验器材处理和实验步骤 | 第46页 |
| ·RNA质量检测 | 第46页 |
| ·两步法realtimePCR先反转录得到各个条件下的cDNA模板 | 第46-48页 |
| ·各组条件下,RNA浓度及用量 | 第46-47页 |
| ·反转录体系 | 第47页 |
| ·realtimePCR反应体系和程序 | 第47-48页 |
| ·GSHI和18sRNA目的产物的溶解曲线 | 第48页 |
| ·2~(-△△Ct)值法对烟草叶片组织的GSHI的相对定量分析 | 第48-50页 |
| ·40℃诱导条件下的烟草叶片组织的GSHI的相对定量分析 | 第48-49页 |
| ·4℃诱导条件下的烟草叶片组织的GSHI的相对定量分析 | 第49-50页 |
| ·本章小结 | 第50-51页 |
| 结论 | 第51-54页 |
| 参考文献 | 第54-58页 |
| 附录 | 第58-61页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第61-62页 |
| 致谢 | 第62-63页 |
