| 中文摘要 | 第1-10页 |
| 英文摘要 | 第10-13页 |
| 符号说明 | 第13-14页 |
| 前言 | 第14-17页 |
| 第一部分 构建具有反式激活作用的HBV截短型中蛋白真核表达载体 | 第17-41页 |
| 技术路线 | 第18-19页 |
| 1 材料 | 第19-22页 |
| ·质粒与菌种 | 第19页 |
| ·细胞 | 第19页 |
| ·主要试剂 | 第19页 |
| ·试剂盒 | 第19页 |
| ·DNA分子量marker | 第19页 |
| ·PCR引物 | 第19-20页 |
| ·一般试剂 | 第20-21页 |
| ·主要实验仪器 | 第21-22页 |
| 2 方法 | 第22-34页 |
| ·重组子的构建 | 第22-27页 |
| ·质粒DNA的制备 | 第22-23页 |
| ·目的基因片断的获得 | 第23-25页 |
| ·质粒pcDNA3的酶切线性化与回收 | 第25页 |
| ·目的基因片断与载体的连接 | 第25-26页 |
| ·连接产物的转化 | 第26-27页 |
| ·阳性重组子pcS2与pcTS的筛选鉴定 | 第27页 |
| ·阳性克隆的保存 | 第27页 |
| ·乙肝病毒截短型中蛋白表达载体反式激活作用的研究 | 第27-30页 |
| ·QIAprep Spin minprep试剂盒抽取与纯化质粒DNA | 第27-28页 |
| ·HepG2细胞培养 | 第28-29页 |
| ·脂质体转染 | 第29页 |
| ·细胞的收集与裂解 | 第29-30页 |
| ·荧光素酶表达量的测定 | 第30页 |
| ·稳定表达的乙肝病毒截短型中蛋白对肝癌生物学特性的影响 | 第30-34页 |
| ·脂质体介导HBV截短中蛋白表达载体转染肝癌细胞HepG2 | 第30页 |
| ·阳性克隆的稳定筛选 | 第30页 |
| ·RT-PCR检测HBV截短中蛋白mRNA的表达 | 第30-33页 |
| ·冻存稳定筛选的阳性克隆细胞 | 第33页 |
| ·生长曲线的测定 | 第33页 |
| ·软琼脂集落形成实验 | 第33-34页 |
| 3 结果 | 第34-37页 |
| ·重组子的构 | 第34-35页 |
| ·质粒的获得 | 第34页 |
| ·PCR扩增目的基因片断 | 第34页 |
| ·目的基因片断和载体的酶切回收 | 第34页 |
| ·阳性重组子鉴定 | 第34-35页 |
| ·乙肝病毒截短型中蛋白的反式激活作用 | 第35页 |
| ·脂质体转染 | 第35页 |
| ·乙肝病毒截短型中蛋白对SV40启动子／增强子有反式激活作用 | 第35页 |
| ·乙肝病毒截短型中蛋白对肝癌细胞生物学特性的影响 | 第35-37页 |
| ·阳性克隆的稳定筛选 | 第35-36页 |
| ·RT-PCR检测HBV截短中蛋白mRNA的表达 | 第36页 |
| ·稳定表达的截短型中蛋白抑制肝癌细胞的生长 | 第36页 |
| ·稳定表达的截短型中蛋白抑制肝癌细胞的集落形成能力 | 第36-37页 |
| 4 讨论 | 第37-41页 |
| 第二部分 构建端粒酶逆转录酶启动子报告质粒 | 第41-51页 |
| 技术路线 | 第42-43页 |
| 1 材料 | 第43页 |
| ·质粒 | 第43页 |
| ·细胞 | 第43页 |
| ·引物 | 第43页 |
| ·主要试剂 | 第43页 |
| 2 方法 | 第43-47页 |
| ·重组子pGL3-TRTP的构建 | 第43-44页 |
| ·质粒pCR—TRTP，pGL3-basic的酶切鉴定 | 第43页 |
| ·目的片断TRTP的获取 | 第43-44页 |
| ·载体pGL3-basic线性化 | 第44页 |
| ·目的片断TRTP与载体pGL3-basic的回收与纯化 | 第44页 |
| ·目的基因TRTP与载体的连接 | 第44页 |
| ·重组质粒pGL3-TRTP的转化 | 第44页 |
| ·阳性克隆株pGL3-TRTP的鉴定 | 第44页 |
| ·重组子pGL3-del445的构建 | 第44-46页 |
| ·目的片断Del445的获取 | 第44-45页 |
| ·质粒pGL3-basic的酶切线性化 | 第45页 |
| ·目的基因Del445与载体pGL3-basic的连接 | 第45-46页 |
| ·重组质粒pGL3-del445的转化 | 第46页 |
| ·阳性重组子pGL3-del445的筛选鉴定 | 第46页 |
| ·hTERT启动子活性的验证 | 第46-47页 |
| ·原代细胞的培养 | 第46页 |
| ·RT-PCR检测不同细胞系hTERT的表达 | 第46-47页 |
| ·hTERT启动子活性的鉴定 | 第47页 |
| 3 结果 | 第47-49页 |
| ·重组子的构建 | 第47-48页 |
| ·质粒pCR-TRTP、pGL3-basic的鉴定 | 第47页 |
| ·目的基因片断的获得 | 第47页 |
| ·目的基因片断与载体的酶切回收 | 第47-48页 |
| ·阳性重组子pGL3-TRTP、pGL3-del445的酶切筛选 | 第48页 |
| ·DNA测序及序列分析 | 第48页 |
| ·hTERT启动子活性的验证 | 第48-49页 |
| ·原代细胞HELF的培养 | 第48-49页 |
| ·不同细胞hTERT的表达 | 第49页 |
| ·hTERT启动子在不同细胞系中的活性 | 第49页 |
| 4 讨论 | 第49-51页 |
| 第三部分 MHBst对hTERT启动子的反式激活作用的研究 | 第51-58页 |
| 技术路线 | 第51-52页 |
| 1 材料 | 第52页 |
| 2 方法 | 第52-54页 |
| ·不同细胞hTERT的扩增 | 第52页 |
| ·共转染实验 | 第52页 |
| ·细胞的收集与荧光素酶表达量的测定 | 第52页 |
| ·反义寡核苷酸封闭MHBst表达的最佳量 | 第52-53页 |
| ·脂质体转染 | 第52-53页 |
| ·抽提RNA | 第53页 |
| ·逆转录扩增实验 | 第53页 |
| ·HBV截短中蛋白的PCR扩增 | 第53页 |
| ·反义封闭 | 第53-54页 |
| ·反义封闭后荧光素酶表达量的测定 | 第54页 |
| 3 结果 | 第54-55页 |
| ·不同细胞hTERT的表达 | 第54页 |
| ·HBV截短中蛋白对hTERT启动子的反式激活作用 | 第54-55页 |
| ·共转染验证其反式激活作用 | 第54页 |
| ·最佳反义寡核苷酸浓度 | 第54-55页 |
| ·特异性反式激活作用的验证 | 第55页 |
| 4 讨论 | 第55-58页 |
| 小结 | 第58页 |
| 拟进展计划 | 第58-59页 |
| 参考文献 | 第59-64页 |
| 附图 | 第64-77页 |
| 第一部分附图 | 第64-70页 |
| 第二部分附图 | 第70-75页 |
| 第三部分附图 | 第75-77页 |
| 附录 质粒物理图谱 | 第77-80页 |
| 致谢 | 第80-81页 |
| 发表论文及论著目录 | 第81-82页 |
