| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-7页 |
| 缩略词表 | 第7-8页 |
| 目录 | 第8-13页 |
| 一 前言 | 第13-26页 |
| 1 文献综述 | 第13-24页 |
| ·骨的发生 | 第13-14页 |
| ·成骨细胞发展阶段 | 第14-15页 |
| ·成骨分化调控的研究和进展 | 第15-19页 |
| ·激素和维生素 | 第15页 |
| ·胰岛素样生长因子 | 第15页 |
| ·转化生长因子 | 第15-16页 |
| ·成纤维细胞生长因子 | 第16页 |
| ·肝细胞生长因子 | 第16页 |
| ·骨形态发生蛋白 | 第16-17页 |
| ·Runx2/Cbfal | 第17-19页 |
| ·Dlx5和Dlx6 | 第19页 |
| ·Osterix的研究与进展 | 第19-22页 |
| ·Osterix的结构 | 第19-20页 |
| ·Osterix的功能 | 第20页 |
| ·Osterix的表达调控和研究进展 | 第20-22页 |
| ·Tet-on系统 | 第22-24页 |
| 2 本论文的研究内容及意义 | 第24-25页 |
| ·研究内容 | 第24页 |
| ·研究意义 | 第24-25页 |
| 3 研究思路 | 第25-26页 |
| 二 实验材料与仪器 | 第26-31页 |
| 1 材料 | 第26-30页 |
| ·细胞株及主要试剂、试剂盒 | 第26-27页 |
| ·常用试剂及配方 | 第27-30页 |
| ·细胞培养试剂及配方 | 第27-29页 |
| ·分子克隆所用试剂及配方 | 第29-30页 |
| 2 仪器与设备 | 第30-31页 |
| 三 实验方法 | 第31-51页 |
| 1 pTRE-Osx重组质粒的构建 | 第31-37页 |
| ·实验设计 | 第31-32页 |
| ·PCR扩增 | 第32-33页 |
| ·切胶回收纯化PCR或酶切产物 | 第33-34页 |
| ·PCR产物和质粒的酶切 | 第34页 |
| ·载体去磷酸化反应 | 第34-35页 |
| ·连接反应 | 第35页 |
| ·大肠杆菌DH5α感受态的制备及CaCl2转化 | 第35页 |
| ·质粒抽提及单克隆的酶切鉴定 | 第35-37页 |
| 2 Luciferase报告检测系统工作状态 | 第37-39页 |
| ·实验设计 | 第37页 |
| ·细胞复苏、培养和冻存 | 第37页 |
| ·乙醇沉淀法制备转染用质粒 | 第37-38页 |
| ·质粒转染细胞 | 第38页 |
| ·Lucifersae活性检测方法验证阳性克隆 | 第38-39页 |
| 3 筛选C2C12-pTet-pTRE-Osx细胞株 | 第39-46页 |
| ·用G418筛选C2C12-pTet细胞株 | 第39-41页 |
| ·做C2C12细胞的G418杀伤曲线 | 第39页 |
| ·实验设计 | 第39页 |
| ·方法和步骤 | 第39页 |
| ·用G418筛选稳定转染pTet质粒的C2C12细胞株 | 第39-40页 |
| ·制备细胞转染用质粒 | 第39-40页 |
| ·质粒转染C2C12细胞 | 第40页 |
| ·用G418筛选稳定转染pTet质粒的C2C12细胞株 | 第40页 |
| ·Luciferase活性检测方法验证阳性克隆 | 第40-41页 |
| ·实验设计 | 第40-41页 |
| ·方法和步骤 | 第41页 |
| ·用Hyg B筛选C2C12-pTet-pTRE-Osx细胞株 | 第41-46页 |
| ·做C2C 12-pTet细胞的Hyg B杀伤曲线 | 第41-42页 |
| ·实验设计 | 第41页 |
| ·方法和步骤 | 第41-42页 |
| ·用Hyg B筛选稳定转染pTRE-Osx和pTRE质粒的C2C12-pTet细胞株 | 第42页 |
| ·制备细胞转染用质粒 | 第42页 |
| ·质粒转染C2C12-pTet细胞 | 第42页 |
| ·用Hyg B筛选稳定转染pTRE-Osx和pTRE质粒的C2C12-pTet细胞株 | 第42页 |
| ·实时定量PCR方法验证阳性克隆 | 第42-46页 |
| ·实验设计 | 第42-43页 |
| ·制备细胞样品 | 第43页 |
| ·qPCR检测 | 第43-46页 |
| ·检测引物设计 | 第43页 |
| ·总RNA抽提 | 第43-44页 |
| ·用DNase Ⅰ(RNase free)处理RNA | 第44页 |
| ·逆转录 | 第44-45页 |
| ·qPCR | 第45-46页 |
| 4 摸索最佳诱导剂量、诱导应答时间 | 第46-47页 |
| ·摸索最佳诱导剂量 | 第46页 |
| ·实验设计 | 第46页 |
| ·制备细胞样品 | 第46页 |
| ·qPCR检测 | 第46页 |
| ·摸索诱导应答时间 | 第46-47页 |
| ·实验设计 | 第46-47页 |
| ·制备细胞样品 | 第47页 |
| ·qPCR检测 | 第47页 |
| 5 Osterix生物学功能检测 | 第47-50页 |
| ·MTT法检测细胞增殖情况 | 第47-48页 |
| ·实验设计 | 第47页 |
| ·方法与步骤 | 第47-48页 |
| ·制备细胞样品 | 第47-48页 |
| ·MTT法检测细胞增殖情况 | 第48页 |
| ·流式细胞术检测细胞周期 | 第48页 |
| ·实验设计 | 第48页 |
| ·方法与步骤 | 第48页 |
| ·制备细胞样品 | 第48页 |
| ·流式细胞术检测细胞周期 | 第48页 |
| ·钙钴法染色检测成骨分化情况 | 第48-49页 |
| ·实验设计 | 第48-49页 |
| ·方法与步骤 | 第49页 |
| ·制备细胞样品 | 第49页 |
| ·钙钴法染色 | 第49页 |
| ·茜素红染色检测骨节结成熟度 | 第49-50页 |
| ·实验设计 | 第49页 |
| ·方法与步骤 | 第49-50页 |
| ·制备细胞样品 | 第49-50页 |
| ·茜素红染色 | 第50页 |
| 6 qPCR检测相关基因的变化 | 第50-51页 |
| ·实验设计 | 第50页 |
| ·检测引物设计 | 第50-51页 |
| ·qPCR方法检测相关基因的变化 | 第51页 |
| 四结果与分析 | 第51-63页 |
| 1 pTRE-Osx重组质粒的构建 | 第51页 |
| 2 Luciferase报告检测系统工作状态 | 第51-52页 |
| 3 筛选C2C12-pTet-pTRE-Osx细胞株 | 第52-55页 |
| ·用G418筛选C2C12-pTet细胞株 | 第52-54页 |
| ·做C2C12细胞的G418杀伤曲线 | 第52-53页 |
| ·Luciferase活性检测方法验证阳性克隆 | 第53-54页 |
| ·用Hyg B筛选C2C12-pTet-pTRE-Osx细胞株 | 第54-55页 |
| ·做C2C12-pTet细胞的Hyg B杀伤曲线 | 第54页 |
| ·实时定量PCR方法验证阳性克隆 | 第54-55页 |
| 4 摸索最佳诱导剂量、诱导应答时间 | 第55-57页 |
| ·摸索最佳诱导剂量 | 第55-56页 |
| ·摸索诱导应答时间 | 第56-57页 |
| 5 Osterix生物学功能检测 | 第57-63页 |
| ·MTT法检测细胞增殖情况 | 第57-58页 |
| ·流式细胞术检测细胞周期 | 第58-63页 |
| 五讨论 | 第63-67页 |
| 参考文献 | 第67-76页 |
| 附录 | 第76-80页 |
| 在学期间发表论文清单 | 第80-81页 |
| 致谢 | 第81-82页 |
