| 摘要 | 第6-7页 |
| Abstract | 第7页 |
| 第一章 文献综述 | 第10-20页 |
| 1.人类多能干细胞及其应用 | 第10-11页 |
| 2.CRISPR/Cas9的发展及其应用 | 第11-15页 |
| 3.CRISPR/Cas9在人多能干细胞中的应用 | 第15-16页 |
| 4.NOA的研究概况 | 第16-18页 |
| 5.NOA治疗手段的研究 | 第18-20页 |
| 第二章 实验材料和方法 | 第20-35页 |
| 一.实验材料 | 第20-22页 |
| 1.感受态细胞 | 第20页 |
| 2.细胞 | 第20页 |
| 3.质粒 | 第20页 |
| 4.抗体 | 第20页 |
| 5.主要试剂和试剂盒 | 第20-21页 |
| 6.要实验耗材和仪器 | 第21-22页 |
| 二.主要试剂配制方法 | 第22-24页 |
| 1.液态LB培养基 | 第22页 |
| 2.固态LB培养基 | 第22-23页 |
| 3.10× PBS缓冲液 | 第23页 |
| 4.1×DPBS缓冲液1L(细胞培养级) | 第23页 |
| 5.0.5 mM EDTA消化液500ml | 第23页 |
| 6.293T细胞的培养液 | 第23-24页 |
| 7.人多能干细胞培养液(PSCeasy) | 第24页 |
| 三.主要实验方法 | 第24-35页 |
| 1.质粒转化 | 第24页 |
| 2.质粒小量提取 | 第24-25页 |
| 3.质粒大量提取 | 第25页 |
| 4. PCR产物凝胶回收 | 第25-26页 |
| 5.克隆载体的构建 | 第26-28页 |
| 6.293T细胞和3T3细胞的培养 | 第28页 |
| 7.慢病毒包装和病毒浓缩 | 第28-29页 |
| 8.人胚胎干细胞的复苏和培养 | 第29页 |
| 9.人胚胎干细胞的传代培养(普通传代,单细胞传代) | 第29-30页 |
| 10.人多能干细胞向生殖细胞分化 | 第30页 |
| 11.人多能干细胞稳转细胞系的建立 | 第30页 |
| 12.总RNA的提取 | 第30-31页 |
| 13.RNA反转录 | 第31页 |
| 14.实时定量PCR (real-time PCR) | 第31页 |
| 15.流式胞内PLZF染色分析 | 第31-32页 |
| 16.细胞基因组DNA的提取 | 第32页 |
| 17.酶切法检测突变体 | 第32页 |
| 18.蛋白质免疫印迹 | 第32-34页 |
| 19.免疫荧光染色 | 第34-35页 |
| 第三章 实验结果与分析 | 第35-52页 |
| 1.构建Dox诱导的CRISPR/Cas9表达载体 | 第35-36页 |
| 2.建立Cas9可诱导表达的hPSCs | 第36-38页 |
| 3.高效率建立基因敲除的hPSCs | 第38-42页 |
| 4.利用CRISPR/Cas9进行基因组大片段删除 | 第42-46页 |
| 5.基因编辑hPSCs多能性的鉴定 | 第46-48页 |
| 6.基因敲除hPSCs在生殖细胞分化体系(IVD7)中分化和进行基因研究 | 第48-50页 |
| 7.利用表达Cas9干细胞系(H1-iCas9)进行基因筛选 | 第50-52页 |
| 第四章 总结与讨论 | 第52-55页 |
| 附录 | 第55-57页 |
| 参考文献 | 第57-63页 |
| 致谢 | 第63-64页 |
