| 摘要 | 第3-5页 |
| abstract | 第5-6页 |
| 第1章 绪论 | 第11-22页 |
| 1.1 选题依据和意义 | 第11-13页 |
| 1.2 抗植物病毒蛋白研究状况 | 第13-14页 |
| 1.3 食用菌生物活性蛋白 | 第14-18页 |
| 1.3.1 核糖体失活蛋白 | 第15-16页 |
| 1.3.2 免疫调节蛋白 | 第16-17页 |
| 1.3.3 抗动物病毒蛋白 | 第17页 |
| 1.3.4 凝集素 | 第17-18页 |
| 1.4 Y3研究状况 | 第18-19页 |
| 1.5 研究内容与创新点 | 第19-22页 |
| 1.5.1 研究内容 | 第19-20页 |
| 1.5.2 技术路线 | 第20页 |
| 1.5.3 本试验创新点 | 第20-22页 |
| 第2章 蛋白y3基因的克隆和序列分析 | 第22-40页 |
| 2.1 试验材料 | 第22-24页 |
| 2.1.1 试验菌种 | 第22页 |
| 2.1.2 主要仪器与设备 | 第22页 |
| 2.1.3 主要试剂及试剂盒 | 第22-23页 |
| 2.1.4 主要试剂的配制 | 第23-24页 |
| 2.2 试验方法 | 第24-30页 |
| 2.2.1 菌种的培养和菌丝体的制备 | 第24页 |
| 2.2.2 y3基因扩增用引物 | 第24页 |
| 2.2.3 毛头鬼伞基因组DNA的提取 | 第24-25页 |
| 2.2.4 毛头鬼伞菌丝体总RNA的提取 | 第25页 |
| 2.2.5 真菌总RNA中残余DNA的去除 | 第25-26页 |
| 2.2.6 蛋白y3基因序列的扩增 | 第26-27页 |
| 2.2.7 PCR扩增产物的电泳和纯化 | 第27-28页 |
| 2.2.8 y3基因序列克隆载体的构建 | 第28页 |
| 2.2.9 细菌感受态细胞的制备 | 第28-29页 |
| 2.2.10 大肠杆菌感受态细胞DH5α 的转化 | 第29页 |
| 2.2.11 重组质粒的PCR鉴定和测序 | 第29页 |
| 2.2.12 蛋白y3基因序列的推测与分析 | 第29-30页 |
| 2.3 结果与分析 | 第30-39页 |
| 2.3.1 毛头鬼伞基因组DNA和总RNA的提取 | 第30页 |
| 2.3.2 蛋白y3基因PCR和RT-PCR扩增 | 第30-31页 |
| 2.3.3 重组质粒菌液PCR鉴定结果 | 第31-32页 |
| 2.3.4 蛋白y3基因DNA全长序列测序结果 | 第32-34页 |
| 2.3.5 y3基因DNA序列的比对和分析 | 第34页 |
| 2.3.6 蛋白y3基因c DNA序列测序结果 | 第34-35页 |
| 2.3.7 y3基因c DNA序列的比对和同源性分析 | 第35-36页 |
| 2.3.8 y3基因DNA与cDNA序列的比对 | 第36-39页 |
| 2.3.9 本试验推测的氨基酸序列与已发表序列的比对 | 第39页 |
| 2.4 讨论与小结 | 第39-40页 |
| 第3章 抗TMV蛋白Y3原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达 | 第40-51页 |
| 3.1 试验材料 | 第40-41页 |
| 3.1.1 试验菌种和载体 | 第40页 |
| 3.1.2 病毒和烟草 | 第40页 |
| 3.1.3 主要仪器与设备 | 第40页 |
| 3.1.4 主要试剂及试剂盒 | 第40页 |
| 3.1.5 主要试剂的配制 | 第40-41页 |
| 3.2 试验方法 | 第41-46页 |
| 3.2.1 y3基因c DNA序列原核表达用引物 | 第41页 |
| 3.2.2 y3基因原核表达用cDNA序列的PCR扩增 | 第41-42页 |
| 3.2.3 PCR扩增产物的电泳和纯化 | 第42页 |
| 3.2.4 y3基因c DNA序列原核表达载体的构建 | 第42-43页 |
| 3.2.5 细菌感受态细胞的制备和转化 | 第43页 |
| 3.2.6 重组质粒的PCR鉴定 | 第43-44页 |
| 3.2.7 蛋白y3基因c DNA序列的测定和分析 | 第44页 |
| 3.2.8 重组质粒PET28a-y3的提取和转化 | 第44页 |
| 3.2.9 蛋白y3的原核表达 | 第44页 |
| 3.2.10表达产物的纯化 | 第44-45页 |
| 3.2.11表达蛋白Western blotting检测 | 第45-46页 |
| 3.2.12 TMV的提纯 | 第46页 |
| 3.2.13表达蛋白抗病毒活性的检测 | 第46页 |
| 3.3 结果与分析 | 第46-50页 |
| 3.3.1 原核表达用y3基因c DNA序列的PCR扩增 | 第46-47页 |
| 3.3.2 重组质粒PET28a-y3的菌液PCR和双酶切鉴定 | 第47-48页 |
| 3.3.3 重组蛋白的SDS-PAGE结果和Western blotting鉴定 | 第48-49页 |
| 3.3.4 y3蛋白对TMV侵染抑制率的测定 | 第49-50页 |
| 3.4 讨论与小结 | 第50-51页 |
| 第4章 抗TMV蛋白Y3真核表达载体的构建及在毕赤酵母中的表达 | 第51-68页 |
| 4.1 试验材料 | 第51-52页 |
| 4.1.1 菌种和质粒 | 第51页 |
| 4.1.2 主要仪器与设备 | 第51页 |
| 4.1.3 病毒和烟草 | 第51页 |
| 4.1.4 主要试剂及试剂盒 | 第51页 |
| 4.1.5 主要试剂的配制 | 第51-52页 |
| 4.2 试验方法 | 第52-57页 |
| 4.2.1 y3基因c DNA序列真核表达用引物 | 第52-53页 |
| 4.2.2 y3基因原核表达序列cDNA的扩增 | 第53页 |
| 4.2.3 PCR扩增产物的电泳和纯化 | 第53页 |
| 4.2.4 蛋白y3基因克隆载体的构建 | 第53-54页 |
| 4.2.5 重组质粒DNA的提取和测序 | 第54页 |
| 4.2.6 y3基因c DNA序列真核表达载体的构建 | 第54页 |
| 4.2.7 重组质粒pPIC9K-y3-T的提取 | 第54-55页 |
| 4.2.8 酵母感受态细胞的制备 | 第55页 |
| 4.2.9 表达载体的序列分析及GS115的转化 | 第55-56页 |
| 4.2.10 转化子表型鉴定 | 第56页 |
| 4.2.11 PCR鉴定阳性转化子 | 第56页 |
| 4.2.12 表达蛋白SDS-PAGE电泳和Western blotting检测 | 第56页 |
| 4.2.13 表达产物浓度的测定及其抗病毒活性的检测 | 第56页 |
| 4.2.14 重组毕赤酵母的诱导表达和发酵条件的优化 | 第56-57页 |
| 4.3 结果与分析 | 第57-67页 |
| 4.3.1 y3基因真核表达用cDNA序列扩增结果 | 第57-58页 |
| 4.3.2 y3基因真核表达载体的构建 | 第58-59页 |
| 4.3.3 真核表达阳性转化子Mut+的鉴定 | 第59-60页 |
| 4.3.4 重组菌表达蛋白的SDS-PAGE和westerning blot鉴定 | 第60页 |
| 4.3.5 Y3蛋白的抗病毒活性检测 | 第60-61页 |
| 4.3.6 重组毕赤酵母诱导表达发酵条件的研究 | 第61-66页 |
| 4.3.7 重组菌株的发酵条件优化结果 | 第66-67页 |
| 4.4 讨论与小结 | 第67-68页 |
| 第5章 结论与展望 | 第68-71页 |
| 5.1 结论 | 第68-69页 |
| 5.1.1 蛋白y3基因的克隆和序列分析 | 第68页 |
| 5.1.2 y3基因原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达 | 第68-69页 |
| 5.1.3 y3基因真核表达载体的构建及在毕赤酵母中的表达 | 第69页 |
| 5.2 展望 | 第69-71页 |
| 致谢 | 第71-72页 |
| 参考文献 | 第72-79页 |
| 攻读学位期间的研究成果 | 第79页 |
