| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 缩写 | 第8-15页 |
| 第一章 绪论 | 第15-22页 |
| 1.1 国内外研究现状 | 第15-19页 |
| 1.2 本论文创新之处 | 第19-22页 |
| 第二章 实验仪器、试剂及基本方法 | 第22-36页 |
| 2.1 仪器 | 第22-23页 |
| 2.2 试剂、药品及耗材 | 第23-25页 |
| 2.3 基础溶液配置 | 第25-27页 |
| 2.4 常用基本实验方法 | 第27-36页 |
| 2.4.1 质粒抽提步骤 | 第27-28页 |
| 2.4.2 PCR产物纯化步骤 | 第28页 |
| 2.4.3 胶回收步骤 | 第28-29页 |
| 2.4.4 感受态的制备与转化 | 第29-30页 |
| 2.4.5 琼脂糖凝胶电泳 | 第30-31页 |
| 2.4.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第31-34页 |
| 2.4.7 Western Blot实验步骤 | 第34页 |
| 2.4.8 细胞培养相关步骤 | 第34-36页 |
| 第三章 双基因共表达嵌合蛋白的研究 | 第36-59页 |
| 3.1 实验目的 | 第36页 |
| 3.2 实验设计 | 第36-38页 |
| 3.2.1 pETduet-1载体基本信息 | 第36-38页 |
| 3.3 实验方法 | 第38-46页 |
| 3.3.1 制备pETduet-1载体 | 第38页 |
| 3.3.2 制备质粒片段pETduet-1 | 第38-39页 |
| 3.3.3 制备插入片段CTB | 第39-41页 |
| 3.3.4 将CTB片段克隆到pETduet-1载体中 | 第41-42页 |
| 3.3.5 制备插入片段EGFP-CTA2-TAT | 第42-44页 |
| 3.3.6 制备载体片段pETduet-CTB | 第44页 |
| 3.3.7 将片段EGFP-CTA2-TAT克隆到pETduet-CTB载体 | 第44-46页 |
| 3.4 双基因表达载体的诱导表达及鉴定 | 第46页 |
| 3.4.1 筛选具有表达优势的菌株 | 第46页 |
| 3.4.2 表达蛋白形式鉴定 | 第46页 |
| 3.5 实验结果 | 第46-58页 |
| 3.5.1 目的基因片段PCR扩增 | 第46-47页 |
| 3.5.2 双基因表达载体pETduet-CTB/EGFP-CTA2-TAT构建 | 第47-56页 |
| 3.5.3 双基因表达载体pETduet-CTB/EGFP-CTA2-TAT的诱导表达 | 第56-58页 |
| 3.6 实验小结 | 第58-59页 |
| 第四章 利用GST优化双基因共表达嵌合蛋白的研究 | 第59-66页 |
| 4.1 实验目的 | 第59页 |
| 4.2 实验步骤 | 第59-60页 |
| 4.2.1 目的基因CTB的PCR扩增 | 第59-60页 |
| 4.2.2 表达载体的构建 | 第60页 |
| 4.2.3 蛋白表达情况分析 | 第60页 |
| 4.3 实验结果 | 第60-64页 |
| 4.3.1 pETduet-GST-CTB/EGFP-CTA2-TAT载体构建结果 | 第60-64页 |
| 4.3.2 蛋白表达情况分析 | 第64页 |
| 4.4 实验小结 | 第64-66页 |
| 第五章 体外组装获得嵌合蛋白的研究 | 第66-94页 |
| 5.1 实验目的 | 第66页 |
| 5.2 实验设计 | 第66页 |
| 5.3 实验步骤 | 第66-77页 |
| 5.3.1 菌种保存、活化及生长曲线测定 | 第66-67页 |
| 5.3.2 蛋白CTB表达及鉴定 | 第67页 |
| 5.3.3 优化CTB蛋白表达条件 | 第67-69页 |
| 5.3.4 CTB的纯化 | 第69-71页 |
| 5.3.5 CTB的复性 | 第71-72页 |
| 5.3.6 EGFP-CTA2-TAT蛋白的表达与纯化 | 第72-75页 |
| 5.3.7 CTB与EGFP-CTA2-TAT体外组装与鉴定 | 第75-77页 |
| 5.4 结果与分析 | 第77-93页 |
| 5.4.1 含质粒pETduet-CTB的BL21(DE3)菌液生长曲线的测定 | 第77页 |
| 5.4.2 蛋白CTB表达及鉴定 | 第77-78页 |
| 5.4.3 诱导转速与时间对CTB表达量的影响 | 第78-79页 |
| 5.4.4 诱导温度与IPTG浓度对CTB表达量的影响 | 第79-81页 |
| 5.4.5 CTB蛋白的纯化 | 第81-82页 |
| 5.4.6 CTB蛋白的复性 | 第82-83页 |
| 5.4.7 重组大肠杆菌BL21(DE3)-pET22b-EGFP-CTA2-TAT生长曲线测定 | 第83-84页 |
| 5.4.8 EGFP-CTA2-TAT蛋白的表达及鉴定 | 第84-85页 |
| 5.4.9 IPTG浓度对EGFP-CTA2-TAT表达量的影响 | 第85-86页 |
| 5.4.10 诱导时间对EGFP-CTA2-TAT蛋白表达量的影响 | 第86-87页 |
| 5.4.11 诱导温度对EGFP-CTA2-TAT蛋白表达量的影响 | 第87-88页 |
| 5.4.12 EGFP-CTA2-TAT蛋白的纯化 | 第88-89页 |
| 5.4.13 蛋白定量标准曲线 | 第89-90页 |
| 5.4.14 Native PAGE鉴定EGFP-CTA2-TAT/(CTB)5 | 第90-91页 |
| 5.4.15 分子筛型HPLC鉴定EGFP-CTA2-TAT/(CTB)5 | 第91-93页 |
| 5.5 实验小结 | 第93-94页 |
| 第六章 嵌合蛋白EGFP-CTA2-TAT/(CTB)5体外活性的研究 | 第94-98页 |
| 6.1 实验目的 | 第94页 |
| 6.2 实验设计 | 第94页 |
| 6.3 实验步骤 | 第94-95页 |
| 6.3.1 神经节苷脂GM1-ELISA实验 | 第94-95页 |
| 6.3.2 细胞穿膜实验 | 第95页 |
| 6.4 实验结果 | 第95-97页 |
| 6.4.1 神经节苷脂GM1-ELISA实验 | 第95-96页 |
| 6.4.2 细胞穿膜实验 | 第96-97页 |
| 6.5 实验小结 | 第97-98页 |
| 结论与展望 | 第98-100页 |
| 参考文献 | 第100-105页 |
| 附录 | 第105-107页 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 | 第107-109页 |
| 致谢 | 第109页 |
