| 西北师范大学研究生学位论文作者信息 | 第5-12页 |
| 中文摘要 | 第12-14页 |
| Abstract | 第14-15页 |
| 缩写词表 | 第16-18页 |
| 第一章 文献综述 | 第18-34页 |
| 1 磷脂酶D(PLD)的研究进展 | 第18-27页 |
| 1.1 PLD 的发现 | 第18页 |
| 1.2 PLD 的生化特性 | 第18-21页 |
| 1.2.1 PLD 的底物特异性 | 第18-19页 |
| 1.2.2 PLD 的亚细胞定位和组织分布 | 第19页 |
| 1.2.3 PLD 的活性受 Ca2+的调控 | 第19-20页 |
| 1.2.4 PLD 的活性受 PH 值调控 | 第20页 |
| 1.2.5 肌醇磷脂类对 PLD 的活性的调控 | 第20页 |
| 1.2.6 PLD 的活性受 G 蛋白调控 | 第20-21页 |
| 1.3 PLD 的信号传导作用 | 第21-24页 |
| 1.3.1 PLD 参与植物激素的信号转导 | 第21-22页 |
| 1.3.2 PLD 参与低温胁迫的信号转导 | 第22-23页 |
| 1.3.3 PLD 参与机械损伤的信号转导 | 第23页 |
| 1.3.4 PLD 参与磷胁迫的信号转导 | 第23页 |
| 1.3.5 PLD 参与的其它胁迫下的信号转导 | 第23-24页 |
| 1.4 植物 PLD 的分子生物学研究进展 | 第24-26页 |
| 1.4.1 植物 PLD 基因和序列分析 | 第24页 |
| 1.4.2 PLD 氨基酸序列结构 | 第24-26页 |
| 1.4.2.1 HKD 结构域 | 第24页 |
| 1.4.2.2 “IYIENQYF”基序 | 第24-25页 |
| 1.4.2.3 PIP2 结合域 | 第25页 |
| 1.4.2.4 C2 结构域 | 第25页 |
| 1.4.2.5 PH 结构域 | 第25-26页 |
| 1.4.2.6 PX 结构域 | 第26页 |
| 1.4.2.7 前导肽 | 第26页 |
| 1.4.2.8 修饰位点 | 第26页 |
| 1.5 PLD 的利用现状及展望 | 第26-27页 |
| 2 低温胁迫下植物的生理及分子生物学适应机制研究概况 | 第27-31页 |
| 2.1 植物在低温胁迫下的生理反应 | 第27-29页 |
| 2.1.1 低温对植物膜系统的影响 | 第27-28页 |
| 2.1.2 低温对植物体内渗透调节物质的影响 | 第28-29页 |
| 2.1.3 低温对植物体内抗氧化酶系统的影响 | 第29页 |
| 2.2 植物响应低温胁迫的分子机制 | 第29-31页 |
| 3 高山冰缘植物抗冷性研究概况 | 第31-32页 |
| 4 研究目的及意义 | 第32-34页 |
| 第二章 材料与方法 | 第34-48页 |
| 1 试验材料 | 第34页 |
| 1.1 植物材料的培养 | 第34页 |
| 1.2 菌株与载体 | 第34页 |
| 1.3 酶及各种生化试剂 | 第34页 |
| 2 试验方法 | 第34-48页 |
| 2.1 高山离子芥总 RNA 的提取及反转录 | 第34-35页 |
| 2.2 高山离子芥磷脂酶 Dα基因 CbPLDα的克隆 | 第35-37页 |
| 2.2.1 CbPLDα中间片段的克隆 | 第35页 |
| 2.2.2 RACE 法克隆 CbPLDα基因全长 | 第35-36页 |
| 2.2.3 CbPLDα全长基因的扩增 | 第36页 |
| 2.2.4 CbPLDα基因生物信息学分析 | 第36-37页 |
| 2.2.4.1 根据测序结果推导 CbPLDα氨基酸序列 | 第36页 |
| 2.2.4.2 构建各基因序列的系统发育树 | 第36页 |
| 2.2.4.3 蛋白质高级空间结构预测以及蛋白质特征的分析 | 第36-37页 |
| 2.3 高山离子芥磷脂酶 Dδ基因 CbPLDδ的克隆 | 第37-39页 |
| 2.3.1 CbPLDδ中间片段的克隆 | 第37-38页 |
| 2.3.1.1 第一次扩增 | 第37页 |
| 2.3.1.2 第二次扩增 | 第37页 |
| 2.3.1.3 第三次扩增 | 第37-38页 |
| 2.3.1.4 拼接 CbPLDδ部分片段序列 | 第38页 |
| 2.3.2 RACE 法克隆 CbPLDδ基因全长 | 第38-39页 |
| 2.3.2.1 CbPLDδ 3′RACE 扩增 | 第38页 |
| 2.3.2.2 CbPLDδ 5′RACE 扩增 | 第38-39页 |
| 2.3.3 CbPLDδ全长基因的扩增 | 第39页 |
| 2.3.4 CbPLDδ基因生物信息学分析 | 第39页 |
| 2.3.4.1 根据测序结果推导 CbPLDδ氨基酸序列 | 第39页 |
| 2.3.4.2 构建各基因序列的系统发育树 | 第39页 |
| 2.3.4.3 蛋白质高级空间结构预测以及蛋白质特征的分析 | 第39页 |
| 2.4 CbPLDα和 CbPLDδ基因在低温胁迫下的功能研究 | 第39-40页 |
| 2.4.1 CbPLDα和 CbPLDδ基因表达的实时荧光定量分析 | 第39-40页 |
| 2.4.2 CbPLDα和 CbPLDδ基因组织特异性表达检测 | 第40页 |
| 2.5 高山离子芥 PLD 活性的测定 | 第40-41页 |
| 2.6 低温胁迫下高山离子芥试管苗生理生化代谢调控作用研究 | 第41-44页 |
| 2.6.1 低温胁迫下高山离子芥试管苗膜系统伤害程度指标的测定 | 第41页 |
| 2.6.1.1 相对电导率（REC）的测定 | 第41页 |
| 2.6.1.2 丙二酸（MDA）含量的测定 | 第41页 |
| 2.6.2 低温胁迫下高山离子芥试管苗叶片中渗透调节物质含量的测定 | 第41-42页 |
| 2.6.2.1 脯氨酸（Pro）含量的测定（磺基水杨酸法测定） | 第41-42页 |
| 2.6.2.2 可溶性糖（SS）含量的测定（蒽酮比色法） | 第42页 |
| 2.6.2.3 可溶性蛋白（SP）含量的测定（考马斯亮蓝 G-250 法） | 第42页 |
| 2.6.3 低温胁迫下高山离子芥试管苗叶片中抗氧化酶系的测定 | 第42-43页 |
| 2.6.3.1 过氧化氢（H2O2）含量的测定（碘化钾法） | 第42页 |
| 2.6.3.2 超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定（氮蓝四唑法） | 第42页 |
| 2.6.3.3 过氧化物酶（POD）活性的测定（愈创木酚显色法） | 第42-43页 |
| 2.6.3.4 过氧化氢酶（CAT）活性的测定 | 第43页 |
| 2.6.3.5 抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定 | 第43页 |
| 2.6.4 低温胁迫下高山离子芥试管苗叶片中抗坏血酸-谷胱甘肽（AsA-GSH）循环系统的测定 | 第43-44页 |
| 2.6.4.1 单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）活性的测定 | 第43页 |
| 2.6.4.2 谷胱甘肽还原酶（GR）活性的测定 | 第43-44页 |
| 2.6.4.3 以还原型谷胱甘肽（GSH）含量的测定 | 第44页 |
| 2.7 农杆菌介导的 CbPLDα和 CbPLDβ基因转化烟草 | 第44-48页 |
| 2.7.1 含有 CbPLDα基因植物表达载体的构建 | 第44-45页 |
| 2.7.1.1 目的片段的扩增 | 第44页 |
| 2.7.1.2 pBI121载体质粒和含有目的基因片段的pTG19T-PLDα质粒的提取和纯化 | 第44页 |
| 2.7.1.3 pBI121 载体质粒和 pTG19T-PLDα质粒的双酶切 | 第44-45页 |
| 2.7.1.4 粘性末端连接 | 第45页 |
| 2.7.1.5 转化和阳性克隆筛选 | 第45页 |
| 2.7.2 含有 CbPLDβ基因植物表达载体的构建 | 第45页 |
| 2.7.3 农杆菌感受态细胞的制备 | 第45页 |
| 2.7.4 冻融法转化农杆菌 | 第45-46页 |
| 2.7.5 转基因烟草的获得 | 第46-47页 |
| 2.7.5.1 农杆菌的培养 | 第46页 |
| 2.7.5.2 选择培养中抗性筛选 Kan 选择压的确定 | 第46页 |
| 2.7.5.3 选择培养中抑菌抗生素 Car 浓度的确定 | 第46页 |
| 2.7.5.4 烟草的转化 | 第46页 |
| 2.7.5.5 抗性愈伤组织筛选及出芽诱导 | 第46页 |
| 2.7.5.6 转化植株的诱根培养和移栽 | 第46-47页 |
| 2.7.6 转基因烟草的 PCR 检测 | 第47-48页 |
| 2.7.6.1 烟草总 DNA 的提取 | 第47页 |
| 2.7.6.2 PCR 扩增反应 | 第47-48页 |
| 第三章 高山离子芥PLD基因CbPLDα的克隆及结构分析 | 第48-59页 |
| 1 结果与分析 | 第48-58页 |
| 1.1 高山离子芥愈伤组织总 RNA 的提取 | 第48页 |
| 1.2 高山离子芥 CbPLDα基因中间片段的克隆 | 第48-50页 |
| 1.3 高山离子芥 CbPLDα基因 3′RACE 扩增结果 | 第50-51页 |
| 1.4 高山离子芥 CbPLDα基因 5′RACE 扩增结果 | 第51-52页 |
| 1.5 CbPLDα全长基因的扩增 | 第52-53页 |
| 1.6 CbPLDα基因生物信息学分析 | 第53-58页 |
| 1.6.1 CbPLDα基因与多种植物的 PLD 基因预测氨基酸序列比对（%） | 第53-54页 |
| 1.6.2 CbPLDα基因与多种植物的 PLD 基因序列遗传进化树分析 | 第54-55页 |
| 1.6.3 二级结构预测 | 第55-56页 |
| 1.6.4 CbPLDα预测蛋白质等电点及分子量计算 | 第56页 |
| 1.6.5 CbPLDα蛋白其他指标的分析预测 | 第56-58页 |
| 2 讨论 | 第58-59页 |
| 第四章 高山离子芥PLD基因CbPLDδ的克隆及结构分析 | 第59-72页 |
| 1 结果与分析 | 第59-70页 |
| 1.1 高山离子芥 CbPLDδ基因中间片段的克隆 | 第59-63页 |
| 1.1.1 第一次扩增 | 第59-60页 |
| 1.1.2 第二次扩增 | 第60-61页 |
| 1.1.3 第三次扩增 | 第61-62页 |
| 1.1.4 拼接 CbPLDδ部分片段序列 | 第62-63页 |
| 1.2 高山离子芥 CbPLDδ基因 3′RACE 扩增结果 | 第63-64页 |
| 1.3 高山离子芥 CbPLDδ基因 5′RACE 扩增结果 | 第64-65页 |
| 1.4 CbPLDδ全长基因的扩增 | 第65-66页 |
| 1.5 CbPLDδ基因生物信息学分析 | 第66-70页 |
| 1.5.1 CbPLDδ基因与多种植物的 PLD 基因预测氨基酸序列比对（%） | 第66-67页 |
| 1.5.2 CbPLDδ基因与多种植物的 PLD 基因序列遗传进化树分析 | 第67-68页 |
| 1.5.3 二级结构预测 | 第68页 |
| 1.5.4 CbPLDδ预测蛋白质等电点及分子量计算 | 第68-69页 |
| 1.5.5 CbPLDδ蛋白其他指标的分析预测 | 第69-70页 |
| 2 讨论 | 第70-72页 |
| 第五章 CbPLDα和CbPLDδ基因在低温胁迫下的功能研究 | 第72-77页 |
| 1 结果与分析 | 第72-75页 |
| 1.1 CbPLDα基因表达的实时荧光定量分析 | 第72页 |
| 1.2 CbPLDα基因组织特异性表达检测 | 第72-73页 |
| 1.3 CbPLDδ基因表达的实时荧光定量分析 | 第73-74页 |
| 1.4 CbPLDδ基因组织特异性表达检测 | 第74页 |
| 1.5 高山离子芥 PLD 活性的测定 | 第74-75页 |
| 2 讨论 | 第75-77页 |
| 第六章 低温胁迫下高山离子芥试管苗生理生化代谢调控作用研究 | 第77-90页 |
| 1 结果与分析 | 第77-85页 |
| 1.1 低温胁迫下高山离子芥试管苗膜系统伤害程度指标的测定 | 第77-78页 |
| 1.1.1 低温胁迫对高山离子芥试管苗叶片相对电导率的影响 | 第77页 |
| 1.1.2 低温胁迫对高山离子芥试管苗叶片 MDA 含量的影响 | 第77-78页 |
| 1.2 低温胁迫下高山离子芥试管苗叶片渗透调节物质含量的测定 | 第78-80页 |
| 1.2.1 低温胁迫对高山离子芥试管苗叶片中脯氨酸含量的影响 | 第78-79页 |
| 1.2.2 低温胁迫对高山离子芥试管苗叶片中可溶性糖含量的影响 | 第79页 |
| 1.2.3 低温胁迫对高山离子芥试管苗叶片中可溶性蛋白含量的影响 | 第79-80页 |
| 1.3 低温胁迫下高山离子芥试管苗叶片中抗氧化酶系的测定 | 第80-83页 |
| 1.3.1 低温胁迫对高山离子芥试管苗叶片 H2O2含量的影响 | 第80页 |
| 1.3.2 低温胁迫对高山离子芥试管苗叶片中 SOD 活性的影响 | 第80-81页 |
| 1.3.3 低温胁迫对高山离子芥试管苗叶片中 POD 活性的影响 | 第81-82页 |
| 1.3.4 低温胁迫对高山离子芥试管苗叶片中 CAT 活性的影响 | 第82页 |
| 1.3.5 低温胁迫对高山离子芥试管苗叶片中 APX 活性的影响 | 第82-83页 |
| 1.4 低温胁迫下高山离子芥试管苗叶片中抗坏血酸-谷胱甘肽（AsA-GSH）循环系统的测定 | 第83-85页 |
| 1.4.1 低温胁迫对高山离子芥试管苗叶片 AsA-GSH 循环中 MDHAR 活性的影响 | 第83页 |
| 1.4.2 低温胁迫对高山离子芥试管苗叶片 AsA-GSH 循环中 GR 活性的影响 | 第83-84页 |
| 1.4.3 低温胁迫对高山离子芥试管苗叶片 GSH 含量的影响 | 第84-85页 |
| 2 讨论 | 第85-90页 |
| 2.1 低温胁迫下高山离子芥试管苗细胞中膜脂过氧化程度的变化 | 第85页 |
| 2.2 低温胁迫下高山离子芥试管苗叶片渗透调节物质含量的变化 | 第85-87页 |
| 2.3 低温胁迫下高山离子芥试管苗叶片中保护酶活性及 H2O2含量的变化 | 第87-88页 |
| 2.4 低温胁迫下高山离子芥试管苗细胞中 AsA-GSH 循环的变化 | 第88-90页 |
| 第七章 农杆菌介导的CbPLDα和CbPLDβ基因转化烟草 | 第90-96页 |
| 1 结果与分析 | 第90-95页 |
| 1.1 含有 CbPLDα和 CbPLDβ基因植物表达载体的构建 | 第90-92页 |
| 1.2 转基因烟草的获得 | 第92-94页 |
| 1.2.1 选择培养中抗性筛选 Kan 选择压的确定 | 第92页 |
| 1.2.2 选择培养中抑菌抗生素 Car 浓度的确定 | 第92-93页 |
| 1.2.3 转基因烟草的获得 | 第93-94页 |
| 1.3 转基因烟草的 PCR 检测 | 第94-95页 |
| 2 讨论 | 第95-96页 |
| 第八章 结论 | 第96-97页 |
| 参考文献 | 第97-110页 |
| 硕士期间发表的学术论文 | 第110-111页 |
| 致谢 | 第111页 |
