| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 绪论 | 第10-21页 |
| 1.1 头孢菌素类的抗生素 | 第10页 |
| 1.2 7-ACA的市场状态 | 第10-11页 |
| 1.3 7-ACA生产方法的比较 | 第11-12页 |
| 1.4 头孢菌素酰化酶 | 第12-15页 |
| 1.4.1 头孢菌素酰化酶的分类 | 第12-13页 |
| 1.4.2 头孢菌素酰化酶的结构和催化机制 | 第13-14页 |
| 1.4.3 头孢菌素C酰化酶的研究进展 | 第14-15页 |
| 1.5 影响蛋白热稳定性主要因素 | 第15-16页 |
| 1.6 酶分子稳定性改造的策略 | 第16-19页 |
| 1.6.1 理性设计 | 第16页 |
| 1.6.2 定向进化技术 | 第16-17页 |
| 1.6.3 半理性设计 | 第17-19页 |
| 1.7 自动化工作站筛选平台 | 第19页 |
| 1.8 本课题的研究意义 | 第19-20页 |
| 1.9 本课题的研究内容 | 第20-21页 |
| 第二章 实验所需材料与方法 | 第21-34页 |
| 2.1 实验所需材料 | 第21-24页 |
| 2.1.1 实验所需质粒和菌株 | 第21页 |
| 2.1.2 培养基 | 第21-22页 |
| 2.1.3 试剂与溶液 | 第22-23页 |
| 2.1.4 主要仪器 | 第23-24页 |
| 2.1.5 基因合成与相关引物 | 第24页 |
| 2.2 实验方法 | 第24-34页 |
| 2.2.1 小量PCR扩增体系 | 第24-25页 |
| 2.2.2 酶切DNA的反应 | 第25页 |
| 2.2.3 小量PCR纯化试剂盒 | 第25-26页 |
| 2.2.4 酶连DNA反应 | 第26页 |
| 2.2.5 大肠杆菌的复苏和低温保藏 | 第26页 |
| 2.2.6 制备大肠杆菌感受态细胞 | 第26-27页 |
| 2.2.7 对构建的质粒进行酶切验证 | 第27页 |
| 2.2.8 诱导表达CPC酰化酶重组蛋白 | 第27-28页 |
| 2.2.9 酶粗提液的制备 | 第28页 |
| 2.2.10 大肠杆菌组氨酸标签重组蛋白的纯化 | 第28页 |
| 2.2.11 SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳 | 第28-29页 |
| 2.2.12 BCA法测定蛋白浓度 | 第29-30页 |
| 2.2.13 CPC酰化酶活力的测定 | 第30页 |
| 2.2.14 蛋白结构N176的B因子分析和靶标位点的确定 | 第30-31页 |
| 2.2.15 定点饱和突变库的构建 | 第31页 |
| 2.2.16 饱和突变库的筛选 | 第31-32页 |
| 2.2.17 温度对酶活力的影响 | 第32-33页 |
| 2.2.18 动力学常数的测定 | 第33页 |
| 2.2.19 热失活动力学的研究 | 第33-34页 |
| 第三章 在大肠杆菌中表达头孢菌素C酰化酶 | 第34-38页 |
| 3.1 前言 | 第34页 |
| 3.2 材料与方法 | 第34-35页 |
| 3.3 结果与分析 | 第35-37页 |
| 3.3.1 重组质粒的构建 | 第35页 |
| 3.3.2 目的蛋白的表达与检测 | 第35-36页 |
| 3.3.3 CPC酰化酶酶活的测定 | 第36-37页 |
| 3.4 小结 | 第37-38页 |
| 第四章 构建并筛选突变体文库 | 第38-43页 |
| 4.1 前言 | 第38页 |
| 4.2 实验材料与方法 | 第38-39页 |
| 4.2.1 引物 | 第38-39页 |
| 4.3 结果与分析 | 第39-42页 |
| 4.3.1 分析氨基酸的B-factor值并确定突变靶点 | 第39-40页 |
| 4.3.2 Pseudomonas sp. SE83 acyＩＩ S12突变位点的可视化 | 第40页 |
| 4.3.3 构建饱和突变库并筛选 | 第40-42页 |
| 4.4 小结与讨论 | 第42-43页 |
| 第五章 野生型CPC酰化酶和突变体CPC酰化酶的纯化与表征 | 第43-50页 |
| 5.1 前言 | 第43页 |
| 5.2 结果与分析 | 第43-49页 |
| 5.2.1 CPC酰化酶表达纯化及最适温度测定 | 第43-44页 |
| 5.2.2 CPC酰化酶酶活力测定 | 第44-45页 |
| 5.2.3 评估CPC酰化酶的产物抑制情况 | 第45页 |
| 5.2.4 动力学常数的测定 | 第45-46页 |
| 5.2.5 热失活动力学研究 | 第46页 |
| 5.2.6 CPC酰化酶稳定性提高分子机制分析 | 第46-49页 |
| 5.3 小结与讨论 | 第49-50页 |
| 第六章 总结与展望 | 第50-52页 |
| 参考文献 | 第52-54页 |
| 附录 | 第54-59页 |
| 读研期间发表的科研成果 | 第59-60页 |
| 致谢 | 第60-62页 |
