| 摘要 | 第8-10页 |
| abstract | 第10-12页 |
| 主要符号对照表 | 第13-14页 |
| 前言 | 第14-19页 |
| 一、研究背景 | 第14-15页 |
| 二、HO形成机制与内皮细胞向间充质细胞转化途径 | 第15-16页 |
| 三、SMAD7与EndMT以及HO | 第16-17页 |
| 四、总结 | 第17-19页 |
| 第一部分 SMAD7慢病毒载体的构建与有效性评估 | 第19-54页 |
| 一、材料和方法 | 第19-38页 |
| （一）实验对象 | 第19页 |
| 1、病毒包装系统 | 第19页 |
| 2、病毒生产细胞系 | 第19页 |
| （二）实验试剂 | 第19-21页 |
| （三）实验仪器 | 第21页 |
| （四）大鼠SMAD7基因cDNA表达载体构建 | 第21-28页 |
| 1、大鼠组织total RNA提取及cDNA制备 | 第21-25页 |
| 2、SMAD7基因重组表达载体构建 | 第25-28页 |
| （五）大鼠SMAD7基因重组表达载体性能检测 | 第28-36页 |
| 1、去内毒素质粒DNA的制备 | 第28-29页 |
| 2、细胞转染 | 第29-30页 |
| 3、使用Real Time-PCR的方法检测293细胞中SMAD7基因表达 | 第30-34页 |
| 4、Western blotting检测转染前后293细胞中SMAD7蛋白含量 | 第34-36页 |
| （六）Lv-SMAD7慢病毒颗粒的包装和生产 | 第36-38页 |
| 1、复苏P3代液氮保存的 293 TN(Producer Cell Line)细胞 | 第36页 |
| 2、细胞传代培养和状态调整 | 第36-37页 |
| 3、慢病毒包装质粒混合物和SMAD7重组质粒共转染 293TN细胞 | 第37页 |
| 4、病毒滴度的测定 | 第37页 |
| 5、保存 | 第37-38页 |
| 二、实验结果 | 第38-53页 |
| （一）Total RNA提取结果 | 第38-44页 |
| 1、紫外分光光度检测Total RNA | 第38页 |
| 2、Total RNA琼脂糖凝胶电泳结果 | 第38页 |
| 3、PCR扩增目的片段(1300bp) | 第38-39页 |
| 4、阳性克隆筛选结果 | 第39页 |
| 5、序列比对 | 第39-42页 |
| 6、测序结果 | 第42-44页 |
| （二）大鼠SMAD7基因重组表达载体性能检测结果 | 第44-51页 |
| 1、重组质粒DNA提取及质量检测 | 第44-45页 |
| 2、Real Time-PCR检测mRNA含量 | 第45-49页 |
| 3、Western blot检测结果 | 第49-51页 |
| （三）Lv-SMAD7慢病毒颗粒的包装和生产结果 | 第51-53页 |
| 1、检测照片 | 第51-52页 |
| 2、病毒滴度的计算 | 第52-53页 |
| 三、小结 | 第53-54页 |
| 第二部分 转染SMAD7慢病毒载体与大鼠血管内皮细胞的体外共培养研究 | 第54-68页 |
| 一、材料和方法 | 第54-60页 |
| （一）实验对象 | 第54页 |
| （二）实验试剂 | 第54-57页 |
| （三）实验仪器 | 第57页 |
| （四）大鼠主动脉血管内皮细胞的培养以及慢病毒感染 | 第57-59页 |
| 1、大鼠主动脉血管内皮细胞培养条件 | 第57页 |
| 2、慢病毒感染大鼠主动脉血管内皮细胞最佳MOI值测定 | 第57-58页 |
| 3、在最佳MOI值条件下进行大鼠主动脉血管内皮细胞感染实验 | 第58-59页 |
| （五）TGF-β1 刺激内皮细胞及相关蛋白指标检测 | 第59-60页 |
| 1、细胞实验分组 | 第59页 |
| 2、Western blot测定蛋白表达量 | 第59-60页 |
| 二、结果 | 第60-67页 |
| （一）慢病毒感染大鼠主动脉血管内皮细胞最佳MOI值测定 | 第60-61页 |
| （二）内皮细胞慢病毒感染结果 | 第61-62页 |
| （三） Real Time PCR检测结果 | 第62-65页 |
| 1、RNA检测结果 | 第62-63页 |
| 2、PCR反应曲线 | 第63-64页 |
| 3、Ct值统计分析 | 第64-65页 |
| （四）Western blot检测结果 | 第65-66页 |
| 1、胶片扫描 | 第65页 |
| 2、灰度扫描 | 第65页 |
| 3、作图 | 第65-66页 |
| （五）TGF-β1 刺激内皮细胞及相关蛋白指标检测 | 第66-67页 |
| 1、Western blot测定细胞标志蛋白含量胶片扫描 | 第66页 |
| 2、灰度值扫描 | 第66页 |
| 3、作图 | 第66-67页 |
| 三、小结 | 第67-68页 |
| 第三部分 转染SMAD7慢病毒载体局部注射大鼠跟腱损伤后HO模型的实验研究 | 第68-98页 |
| 一、材料和方法 | 第68-77页 |
| （一）实验对象 | 第68页 |
| （二）实验试剂 | 第68-69页 |
| （三）实验仪器 | 第69-70页 |
| （四）大鼠跟腱切断HO实验模型的建立 | 第70-71页 |
| 1、手术方法 | 第70页 |
| 2、X线检查 | 第70页 |
| 3、跟腱的肉眼观察与组织学检查 | 第70-71页 |
| （五）局部注射载SMAD-7 慢病毒颗粒注射大鼠跟腱切断HO实验模型的实验研究 | 第71-77页 |
| 1、实验方法 | 第71页 |
| 2、X线检查 | 第71页 |
| 3、跟腱的肉眼观察与组织学检查 | 第71页 |
| 4、Realtime-PCR检测SMAD7mRNA表达量 | 第71-75页 |
| 5、Western Blot检测组织中细胞标志蛋白相对含量 | 第75-77页 |
| 二、结果 | 第77-96页 |
| （一）大鼠跟腱切断HO实验模型的建立 | 第77-79页 |
| 1、X线摄片结果 | 第77-78页 |
| 2、肉眼和组织学检查结果 | 第78-79页 |
| （二）局部注射载SMAD-7 慢病毒颗粒注射大鼠跟腱切断HO实验模型的实验结果 | 第79-96页 |
| 1、Realtime-PCR检测SMAD7mRNA表达量结果 | 第79-89页 |
| 2、Western Blot检测组织中细胞标志蛋白相对含量结果 | 第89-96页 |
| 三、小结 | 第96-98页 |
| 第四部分 讨论 | 第98-103页 |
| 一、EndMT途径与HO形成之间关系 | 第98页 |
| 二、基因治疗HO | 第98-100页 |
| 三、本研究存在的不足和意义 | 第100页 |
| 四、未来的研究设想 | 第100-103页 |
| （一）SMAD7对TGF-β信号通路下游micro RNA表达的影响 | 第100-101页 |
| （二）CD34抗体修饰的壳聚糖-SMAD7pDNA纳米微球颗粒的临床应用 | 第101-103页 |
| 结论与意义 | 第103-104页 |
| 综述 | 第104-111页 |
| 一、药物疗法 | 第104-106页 |
| 二、放射疗法 | 第106-107页 |
| 三、药物和放疗联合应用 | 第107页 |
| 四、关节活动治疗 | 第107-108页 |
| 五、手术治疗 | 第108-109页 |
| 六、基因治疗 | 第109页 |
| 七、检测手段的改进 | 第109-110页 |
| 八、其他治疗方法 | 第110页 |
| 九、小结 | 第110-111页 |
| 参考文献 | 第111-123页 |
| 在读期间发表论文和参加科研工作情况 | 第123-125页 |
| 致谢 | 第125页 |
