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鸭圆环病毒衣壳蛋白的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立

中文摘要第3-5页
ABSTRACT第5-7页
英文缩略表第8-13页
第一部分 文献综述及研究目的与意义第13-20页
    第一章 鸭圆环病毒检测方法的研究进展第13-20页
        1 引言第13-14页
        2 检测病毒第14-17页
            2.1 检测病毒抗原第14页
                2.1.1 电镜观察第14页
                2.1.2 免疫荧光试验第14页
            2.2 检测病毒基因第14-17页
                2.2.1 常规PCR第14-15页
                2.2.2 多重PCR第15页
                2.2.3 巢式PCR第15-16页
                2.2.4 实时荧光定量PCR第16页
                2.2.5 分子杂交第16-17页
                2.2.6 环介导等温核酸扩增技术第17页
        3 检测病毒抗体第17-18页
            3.1 间接免疫荧光技术第17页
            3.2 间接ELISA第17-18页
        4 展望第18页
        5 选题目的与意义第18-20页
第二部分 试验研究第20-53页
    第二章 鸭圆环病毒GH01株Cap基因的克隆及其分子特征分析第20-35页
        1 材料第20页
            1.1 主要试剂第20页
        2 方法第20-23页
            2.1 病料的来源和处理第20-21页
            2.2 引物设计第21页
            2.3 目的基因的PCR扩增第21页
            2.4 目的基因的T克隆第21-22页
                2.4.1 连接与转化第21-22页
                2.4.2 重组质粒的酶切鉴定第22页
            2.5 序列测定与分析第22-23页
                2.5.1 核苷酸序列分析第22页
                2.5.2 氨基酸序列分析第22-23页
        3 结果第23-33页
            3.1 DuCV Cap基因的PCR扩增第23页
            3.2 重组质粒的构建和鉴定第23-24页
            3.3 序列测定第24页
            3.4 序列分析第24-33页
                3.4.1 DuCV Cap基因相似性及系统进化分析第24-26页
                3.4.2 DuCV Cap蛋白氨基酸组成分析第26页
                3.4.3 DuCV ORF2的保守结构域第26-27页
                3.4.4 DuCV Cap蛋白二级和三级结构预测第27-28页
                3.4.5 DuCV Cap蛋白抗原表位预测第28-29页
                3.4.6 DuCV Cap蛋白糖基化和磷酸化位点预测第29-30页
                3.4.7 DuCV Cap跨膜区和信号肽预测第30-31页
                3.4.8 DuCV Cap基因密码偏嗜性分析第31-33页
                3.4.9 DuCV Cap蛋白亚细胞定位预测第33页
        4 讨论第33-35页
    第三章 鸭圆环病毒GH01株截断Cap基因原核表达及蛋白纯化第35-44页
        1 材料第35页
            1.1 载体和受体菌第35页
            1.2 主要试验仪器第35页
            1.3 主要试剂第35页
        2 方法第35-40页
            2.1 引物设计第35-36页
            2.2 DNA制备第36页
            2.3 DuCV GH01株截断Cap基因T克隆质粒的构建第36-37页
                2.3.1 PCR扩增反应第36-37页
                2.3.2 目标产物电泳第37页
                2.3.3 截断Cap基因的T克隆第37页
                2.3.4 DH5a大肠杆菌感受态细胞的制备第37页
                2.3.5 重组T克隆质粒的转化第37页
                2.3.6 重组质粒的酶切鉴定第37页
            2.4 DuCV GH01株截断Cap基因重组表达质粒的构建第37-39页
                2.4.1 重组质粒与表达载体的酶切和回收第37-38页
                2.4.2 重组表达质粒的获得第38-39页
                2.4.3 连接产物的转化第39页
                2.4.4 重组质粒的提取第39页
                2.4.5 筛选阳性克隆序列第39页
            2.5 pET-32a-cap重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达第39-40页
            2.6 重组蛋白大量表达及纯化第40页
            2.7 蛋白浓度的测定第40页
            2.8 SDS-PAGE分析纯化蛋白效果第40页
        3 结果第40-43页
            3.1 DuCV截断Cap基因的扩增第40-41页
            3.2 pMD18-cap鉴定及测序结果第41页
            3.3 重组表达质粒的构建及诱导表达第41-42页
            3.4 表达蛋白纯化结果第42-43页
        4 讨论第43-44页
    第四章 以Cap重组蛋白作为包被抗原检测DuCV抗血清的间接ELISA方法的建立与应用第44-53页
        1 材料第44页
            1.1 血清第44页
            1.2 主要仪器第44页
            1.3 主要试剂第44页
        2 方法第44-47页
            2.1 间接ELISA方法包被抗原的选择第45页
            2.2 间接ELISA方法的建立第45-46页
                2.2.1 最适抗原包被浓度与血清稀释度的确定第45页
                2.2.2 最佳抗原包被条件的确定第45页
                2.2.3 最佳封闭时间的确定第45-46页
                2.2.4 最佳酶标抗体稀释度的确定第46页
                2.2.5 阴阳临界值的确定第46页
                2.2.6 间接ELISA特异性试验第46页
                2.2.7 间接ELISA敏感性和重复性试验第46页
            2.3 间接ELISA方法的临床应用第46-47页
        3 结果第47-51页
            3.1 间接ELISA方法的建立第47-51页
                3.1.1 最佳抗原包被浓度与血清稀释度的滴定结果第47页
                3.1.2 重组蛋白包被条件的确定第47-48页
                3.1.3 最佳封闭时间的确定第48页
                3.1.4 最佳酶标抗体稀释度的确定第48-49页
                3.1.5 阴阳临界值的确定第49页
                3.1.6 间接ELISA特异性试验第49-50页
                3.1.7 间接ELISA敏感性和重复性试验第50-51页
            3.2 间接ELISA方法的临床应用第51页
        4 讨论第51-53页
第三部分 结论第53-54页
第四部分 参考文献第54-61页
致谢第61-62页
附录第62-66页
作者简介第66页
攻读学位期间完成的学术论文目录第66页

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