中文摘要 | 第3-5页 |
ABSTRACT | 第5-7页 |
英文缩略表 | 第8-13页 |
第一部分 文献综述及研究目的与意义 | 第13-20页 |
第一章 鸭圆环病毒检测方法的研究进展 | 第13-20页 |
1 引言 | 第13-14页 |
2 检测病毒 | 第14-17页 |
2.1 检测病毒抗原 | 第14页 |
2.1.1 电镜观察 | 第14页 |
2.1.2 免疫荧光试验 | 第14页 |
2.2 检测病毒基因 | 第14-17页 |
2.2.1 常规PCR | 第14-15页 |
2.2.2 多重PCR | 第15页 |
2.2.3 巢式PCR | 第15-16页 |
2.2.4 实时荧光定量PCR | 第16页 |
2.2.5 分子杂交 | 第16-17页 |
2.2.6 环介导等温核酸扩增技术 | 第17页 |
3 检测病毒抗体 | 第17-18页 |
3.1 间接免疫荧光技术 | 第17页 |
3.2 间接ELISA | 第17-18页 |
4 展望 | 第18页 |
5 选题目的与意义 | 第18-20页 |
第二部分 试验研究 | 第20-53页 |
第二章 鸭圆环病毒GH01株Cap基因的克隆及其分子特征分析 | 第20-35页 |
1 材料 | 第20页 |
1.1 主要试剂 | 第20页 |
2 方法 | 第20-23页 |
2.1 病料的来源和处理 | 第20-21页 |
2.2 引物设计 | 第21页 |
2.3 目的基因的PCR扩增 | 第21页 |
2.4 目的基因的T克隆 | 第21-22页 |
2.4.1 连接与转化 | 第21-22页 |
2.4.2 重组质粒的酶切鉴定 | 第22页 |
2.5 序列测定与分析 | 第22-23页 |
2.5.1 核苷酸序列分析 | 第22页 |
2.5.2 氨基酸序列分析 | 第22-23页 |
3 结果 | 第23-33页 |
3.1 DuCV Cap基因的PCR扩增 | 第23页 |
3.2 重组质粒的构建和鉴定 | 第23-24页 |
3.3 序列测定 | 第24页 |
3.4 序列分析 | 第24-33页 |
3.4.1 DuCV Cap基因相似性及系统进化分析 | 第24-26页 |
3.4.2 DuCV Cap蛋白氨基酸组成分析 | 第26页 |
3.4.3 DuCV ORF2的保守结构域 | 第26-27页 |
3.4.4 DuCV Cap蛋白二级和三级结构预测 | 第27-28页 |
3.4.5 DuCV Cap蛋白抗原表位预测 | 第28-29页 |
3.4.6 DuCV Cap蛋白糖基化和磷酸化位点预测 | 第29-30页 |
3.4.7 DuCV Cap跨膜区和信号肽预测 | 第30-31页 |
3.4.8 DuCV Cap基因密码偏嗜性分析 | 第31-33页 |
3.4.9 DuCV Cap蛋白亚细胞定位预测 | 第33页 |
4 讨论 | 第33-35页 |
第三章 鸭圆环病毒GH01株截断Cap基因原核表达及蛋白纯化 | 第35-44页 |
1 材料 | 第35页 |
1.1 载体和受体菌 | 第35页 |
1.2 主要试验仪器 | 第35页 |
1.3 主要试剂 | 第35页 |
2 方法 | 第35-40页 |
2.1 引物设计 | 第35-36页 |
2.2 DNA制备 | 第36页 |
2.3 DuCV GH01株截断Cap基因T克隆质粒的构建 | 第36-37页 |
2.3.1 PCR扩增反应 | 第36-37页 |
2.3.2 目标产物电泳 | 第37页 |
2.3.3 截断Cap基因的T克隆 | 第37页 |
2.3.4 DH5a大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第37页 |
2.3.5 重组T克隆质粒的转化 | 第37页 |
2.3.6 重组质粒的酶切鉴定 | 第37页 |
2.4 DuCV GH01株截断Cap基因重组表达质粒的构建 | 第37-39页 |
2.4.1 重组质粒与表达载体的酶切和回收 | 第37-38页 |
2.4.2 重组表达质粒的获得 | 第38-39页 |
2.4.3 连接产物的转化 | 第39页 |
2.4.4 重组质粒的提取 | 第39页 |
2.4.5 筛选阳性克隆序列 | 第39页 |
2.5 pET-32a-cap重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达 | 第39-40页 |
2.6 重组蛋白大量表达及纯化 | 第40页 |
2.7 蛋白浓度的测定 | 第40页 |
2.8 SDS-PAGE分析纯化蛋白效果 | 第40页 |
3 结果 | 第40-43页 |
3.1 DuCV截断Cap基因的扩增 | 第40-41页 |
3.2 pMD18-cap鉴定及测序结果 | 第41页 |
3.3 重组表达质粒的构建及诱导表达 | 第41-42页 |
3.4 表达蛋白纯化结果 | 第42-43页 |
4 讨论 | 第43-44页 |
第四章 以Cap重组蛋白作为包被抗原检测DuCV抗血清的间接ELISA方法的建立与应用 | 第44-53页 |
1 材料 | 第44页 |
1.1 血清 | 第44页 |
1.2 主要仪器 | 第44页 |
1.3 主要试剂 | 第44页 |
2 方法 | 第44-47页 |
2.1 间接ELISA方法包被抗原的选择 | 第45页 |
2.2 间接ELISA方法的建立 | 第45-46页 |
2.2.1 最适抗原包被浓度与血清稀释度的确定 | 第45页 |
2.2.2 最佳抗原包被条件的确定 | 第45页 |
2.2.3 最佳封闭时间的确定 | 第45-46页 |
2.2.4 最佳酶标抗体稀释度的确定 | 第46页 |
2.2.5 阴阳临界值的确定 | 第46页 |
2.2.6 间接ELISA特异性试验 | 第46页 |
2.2.7 间接ELISA敏感性和重复性试验 | 第46页 |
2.3 间接ELISA方法的临床应用 | 第46-47页 |
3 结果 | 第47-51页 |
3.1 间接ELISA方法的建立 | 第47-51页 |
3.1.1 最佳抗原包被浓度与血清稀释度的滴定结果 | 第47页 |
3.1.2 重组蛋白包被条件的确定 | 第47-48页 |
3.1.3 最佳封闭时间的确定 | 第48页 |
3.1.4 最佳酶标抗体稀释度的确定 | 第48-49页 |
3.1.5 阴阳临界值的确定 | 第49页 |
3.1.6 间接ELISA特异性试验 | 第49-50页 |
3.1.7 间接ELISA敏感性和重复性试验 | 第50-51页 |
3.2 间接ELISA方法的临床应用 | 第51页 |
4 讨论 | 第51-53页 |
第三部分 结论 | 第53-54页 |
第四部分 参考文献 | 第54-61页 |
致谢 | 第61-62页 |
附录 | 第62-66页 |
作者简介 | 第66页 |
攻读学位期间完成的学术论文目录 | 第66页 |