| 摘要 | 第3-7页 |
| Abstract | 第7-9页 |
| 目录 | 第10-15页 |
| 图表索引 | 第15-18页 |
| 缩略词表 | 第18-22页 |
| 第1章 绪论 | 第22-44页 |
| 1.1 遗传性疾病研究现状 | 第22页 |
| 1.2 靶向基因组修饰技术 | 第22-26页 |
| 1.3 锌指核酸酶介导的高效率的靶向基因组修饰技术 | 第26-32页 |
| 1.4 锌指核酸酶技术的应用研究 | 第32-36页 |
| 1.4.1 ZFN技术在基础研究中的应用 | 第32-34页 |
| 1.4.2 ZFN技术在特殊细胞模型建立中的应用 | 第34页 |
| 1.4.3 ZFN技术在基因打靶动、植物建立的应用 | 第34-35页 |
| 1.4.4 ZFN技术在基因治疗中的应用 | 第35-36页 |
| 1.5 锌指核酸酶介导的靶向基因组修饰技术存在的问题 | 第36-37页 |
| 1.6 转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription activator-like effectornucleases,TALENs)和RNA引导的核酸酶(RNA-guided nucleases,RGNs)介导的靶向基因组修饰技术 | 第37-44页 |
| 第2章 高灵敏度锌指核酸酶筛选方法的建立 | 第44-68页 |
| 2.1 研究背景 | 第44-46页 |
| 2.2 实验材料 | 第46-53页 |
| 2.2.1 细胞株、菌株及动物模型 | 第46页 |
| 2.2.2 质粒及病毒载体 | 第46-48页 |
| 2.2.3 实验中所用引物列表 | 第48-51页 |
| 2.2.4 主要试剂及试剂盒 | 第51-52页 |
| 2.2.5 常用溶液配方 | 第52页 |
| 2.2.6 实验所需主要设备 | 第52-53页 |
| 2.3 实验方法 | 第53-58页 |
| 2.3.1 细胞系的建立 | 第53-54页 |
| 2.3.2 质粒、病毒载体的构建 | 第54-56页 |
| 2.3.3 常规实验方法 | 第56页 |
| 2.3.4 锌指核酸酶生物活性检测实验 | 第56页 |
| 2.3.5 锌指蛋白的组装 | 第56-58页 |
| 2.3.6 锌指蛋白的筛选 | 第58页 |
| 2.3.7 报告基因纠正实验 | 第58页 |
| 2.4 结果和讨论 | 第58-68页 |
| 2.4.1 锌指蛋白的结合力检测 | 第58-62页 |
| 2.4.2 锌指核酸酶活力的检测 | 第62-67页 |
| 2.4.3 小结与讨论 | 第67-68页 |
| 第3章 同时携带锌指核酸酶和供体DNA的腺病毒载体的构建及其在体内外的打靶效率研究 | 第68-92页 |
| 3.1 研究背景 | 第68-69页 |
| 3.2 实验材料 | 第69-76页 |
| 3.2.1 细胞株、菌株及动物模型 | 第69-70页 |
| 3.2.2 质粒及病毒载体 | 第70-71页 |
| 3.2.3 实验中所用引物列表 | 第71-72页 |
| 3.2.4 主要试剂及试剂盒 | 第72-74页 |
| 3.2.5 常用溶液配方 | 第74页 |
| 3.2.6 实验所需主要设备 | 第74-76页 |
| 3.3 实验方法 | 第76-80页 |
| 3.3.1 细胞系的建立 | 第76页 |
| 3.3.2 质粒、病毒载体的构建 | 第76-77页 |
| 3.3.3 常规实验方法 | 第77页 |
| 3.3.4 报告基因纠正实验 | 第77-78页 |
| 3.3.5 锌指核酸酶毒性检测实验(免疫染色、流式) | 第78页 |
| 3.3.6 体外基因打靶效率检测 | 第78页 |
| 3.3.7 体内基因打靶效率检测 | 第78-79页 |
| 3.3.8 锌指核酸酶切割效率和同源重组效率检测 | 第79页 |
| 3.3.9 病毒包装效率检测 | 第79页 |
| 3.3.10 Southern blot | 第79-80页 |
| 3.4 结果和讨论 | 第80-92页 |
| 3.4.1 严谨型Tet-on调控系统的构建及测试 | 第80-85页 |
| 3.4.2 携带锌指核酸酶和供体DNA的腺病毒在体外靶向纠正的效率研究 | 第85-88页 |
| 3.4.3 携带锌指核酸酶和供体DNA的腺病毒在体内靶向纠正的效率研究 | 第88-89页 |
| 3.4.4 小结与讨论 | 第89-92页 |
| 第4章 携带多个可线性化供体DNA片段的载体在体外的打靶效率研究 | 第92-112页 |
| 4.1 研究背景 | 第92-93页 |
| 4.2 实验材料 | 第93-99页 |
| 4.2.1 细胞株、菌株及动物模型 | 第93页 |
| 4.2.2 质粒及病毒载体 | 第93-95页 |
| 4.2.3 实验中所用引物列表 | 第95-96页 |
| 4.2.4 主要试剂及试剂盒 | 第96-98页 |
| 4.2.5 常用溶液配方 | 第98页 |
| 4.2.6 实验所需主要设备 | 第98-99页 |
| 4.3 实验方法 | 第99-104页 |
| 4.3.1 细胞系的建立 | 第99-100页 |
| 4.3.2 质粒、病毒载体的构建 | 第100-101页 |
| 4.3.3 常规实验方法 | 第101-102页 |
| 4.3.4 报告基因纠正实验 | 第102页 |
| 4.3.5 体外基因打靶效率检测 | 第102页 |
| 4.3.6 锌指核酸酶切割效率和同源重组效率检测 | 第102-103页 |
| 4.3.7 供体DNA细胞内释放效率检测 | 第103页 |
| 4.3.8 Southern blot | 第103-104页 |
| 4.4 结果和讨论 | 第104-112页 |
| 4.4.1 携带多个可线性化供体DNA片段的质粒载体在体外的打靶效率研究 | 第104-108页 |
| 4.4.2 携带多个可线性化供体DNA片段的腺病毒载体在体外的打靶效率研究 | 第108-109页 |
| 4.4.3 小结与讨论 | 第109-112页 |
| 第5章 高效的基因靶向修饰技术在溶酶体储积症致病基因GUS的纠正中的应用研究 | 第112-140页 |
| 5.1 研究背景 | 第112-114页 |
| 5.2 实验材料 | 第114-122页 |
| 5.2.1 细胞株、菌株及动物模型 | 第114页 |
| 5.2.2 质粒及病毒载体 | 第114-116页 |
| 5.2.3 实验中所用引物列表 | 第116-119页 |
| 5.2.4 主要试剂及试剂盒 | 第119-120页 |
| 5.2.5 常用溶液配方 | 第120页 |
| 5.2.6 实验所需主要设备 | 第120-122页 |
| 5.3 实验方法 | 第122-132页 |
| 5.3.1 细胞系的建立 | 第122-123页 |
| 5.3.2 质粒、病毒载体的构建 | 第123-129页 |
| 5.3.3 常规实验方法 | 第129页 |
| 5.3.4 GUS TALENs和GUS sgRNA切割效率的检测 | 第129-131页 |
| 5.3.5 GUS TALENs和Cas9-GUS sgRNA对C57 MEF GUS~(-/-)中突变的GUS基因的纠正效果检测 | 第131-132页 |
| 5.4 结果和讨论 | 第132-140页 |
| 5.4.1 GUS缺失的MEF细胞系的建立 | 第132页 |
| 5.4.2 TALEN介导的靶向基因组编辑技术在GUS突变的疾病模型中的治疗研究 | 第132-134页 |
| 5.4.3 Cas9-sgRNA介导的靶向基因组编辑技术在GUS突变的疾病模型中的治疗研究 | 第134-137页 |
| 5.4.4 小结和讨论 | 第137-140页 |
| 结论 | 第140-142页 |
| 参考文献 | 第142-160页 |
| 附录 | 第160-222页 |
| 附录一 常用试剂配方 | 第160-166页 |
| 附录二 常规实验流程 | 第166-168页 |
| 附录三 研究生期间构建载体列表 | 第168-222页 |
| 致谢 | 第222-226页 |
| 攻读学位期间的研究成果 | 第226-228页 |
