| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 绪论 | 第10-22页 |
| 1.1 氨肽酶的概述 | 第10-12页 |
| 1.1.1 氨肽酶的定义 | 第10页 |
| 1.1.2 氨肽酶的分类 | 第10-11页 |
| 1.1.3 氨肽酶的来源 | 第11页 |
| 1.1.4 氨肽酶的应用 | 第11-12页 |
| 1.1.5 氨肽酶的生产 | 第12页 |
| 1.2 细菌氨肽酶的特性 | 第12-18页 |
| 1.2.1 细菌氨肽酶的理化性质 | 第13-14页 |
| 1.2.2 细菌氨肽酶的表达调控 | 第14页 |
| 1.2.3 细菌氨肽酶的生理功能 | 第14-16页 |
| 1.2.4 细菌氨肽酶的三级结构 | 第16-17页 |
| 1.2.5 细菌氨肽酶的催化机制 | 第17-18页 |
| 1.3 氨肽酶的定向进化研究 | 第18-21页 |
| 1.3.1 定向进化概述 | 第18-19页 |
| 1.3.2 氨肽酶的分子改造研究 | 第19-20页 |
| 1.3.3 计算机模拟技术在蛋白质工程中的应用 | 第20-21页 |
| 1.4 论文的研究背景、意义和主要研究内容 | 第21-22页 |
| 第二章 枯草芽孢杆菌氨肽酶基因克隆表达、酶学性质分析及重组菌产酶条件优化 | 第22-41页 |
| 2.1 前言 | 第22页 |
| 2.2 材料与方法 | 第22-30页 |
| 2.2.1 菌株和质粒 | 第22页 |
| 2.2.2 试剂与仪器 | 第22-23页 |
| 2.2.3 培养基 | 第23页 |
| 2.2.4 DNA 操作方法 | 第23-24页 |
| 2.2.5 B.subtilis Zj016 氨肽酶基因的克隆 | 第24-25页 |
| 2.2.6 BSAP 重组质粒的构建与表达 | 第25-26页 |
| 2.2.7 重组 BSAP 的表达 | 第26页 |
| 2.2.8 重组 BSAP 纯化条件与方法 | 第26-28页 |
| 2.2.9 分析方法 | 第28-30页 |
| 2.2.10 枯草芽孢杆菌重组菌产酶条件优化方法 | 第30页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第30-39页 |
| 2.3.1 B.subtilis Zj016 氨肽酶基因的克隆及序列分析 | 第30-31页 |
| 2.3.2 表达载体 pET-BSAP 和 PMA-BSAP 的构建 | 第31-32页 |
| 2.3.3 重组 BSAP 在 E. coli (pET-BSAP)中的表达与纯化 | 第32-33页 |
| 2.3.4 重组 BSAP 在 B. subtilis (PMA-BSAP)中的表达与纯化 | 第33-34页 |
| 2.3.5 重组 BSAP 动力学参数分析 | 第34页 |
| 2.3.6 重组 BSAP 底物特异性分析 | 第34-35页 |
| 2.3.7 重组 BSAP 最适反应温度和温度稳定性分析 | 第35页 |
| 2.3.8 重组 BSAP 最适反应 pH 和 pH 稳定性分析 | 第35-36页 |
| 2.3.9 二价金属离子对重组 BSAP 酶活影响分析 | 第36-37页 |
| 2.3.10 B. subtilis (PMA-BSAP)产酶条件优化及发酵罐小试 | 第37-39页 |
| 2.4 本章小结 | 第39-41页 |
| 第三章 基于结构分析改造重组 BSAP 底物特异性 | 第41-52页 |
| 3.1 前言 | 第41页 |
| 3.2 材料与方法 | 第41-44页 |
| 3.2.1 菌株和质粒 | 第41页 |
| 3.2.2 试剂与仪器 | 第41页 |
| 3.2.3 培养基和培养条件 | 第41页 |
| 3.2.4 DNA 操作方法 | 第41-43页 |
| 3.2.5 野生型 BSAP 和突变体的纯化条件与方法 | 第43页 |
| 3.2.6 同源建模和底物对接计算机模拟技术 | 第43页 |
| 3.2.7 大豆蛋白水解实验 | 第43-44页 |
| 3.2.8 分析方法 | 第44页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第44-51页 |
| 3.3.1 BSAP 结构同源模拟、底物对接及突变位点选择 | 第44-46页 |
| 3.3.2 BSAP 突变体的表达、筛选及底物特异性分析 | 第46-47页 |
| 3.3.3 不同底物特异性 BSAP 的温度稳定性和二级结构分析 | 第47-48页 |
| 3.3.4 不同底物特异性 BSAP 的反应动力学参数分析 | 第48-50页 |
| 3.3.5 不同底物特异性 BSAP 在大豆蛋白水解实验中效果分析 | 第50-51页 |
| 3.3.6 复合突变对 BSAP 底物特异性的影响 | 第51页 |
| 3.4 本章小结 | 第51-52页 |
| 第四章 柔性结构域缺失提高 BSAP 稳定性和催化效率 | 第52-62页 |
| 4.1 前言 | 第52页 |
| 4.2 材料与方法 | 第52-56页 |
| 4.2.1 菌株和质粒 | 第52页 |
| 4.2.2 试剂与仪器 | 第52-53页 |
| 4.2.3 培养基和培养条件 | 第53页 |
| 4.2.4 DNA 操作方法 | 第53页 |
| 4.2.5 野生型 BSAP 和突变体的纯化条件与方法 | 第53-54页 |
| 4.2.6 分子动力学模拟 | 第54页 |
| 4.2.7 胰蛋白酶水解实验 | 第54页 |
| 4.2.8 大豆蛋白水解实验 | 第54页 |
| 4.2.9 分析方法 | 第54-56页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第56-61页 |
| 4.3.1 BSAP 序列比对及结构分析 | 第56页 |
| 4.3.2 BSAP 和 BSAP-ΔPA 结构分子动力学分析 | 第56-57页 |
| 4.3.3 BSAP-ΔPA 的表达与纯化 | 第57-58页 |
| 4.3.4 BSAP 和 BSAP-ΔPA 稳定性分析 | 第58-59页 |
| 4.3.5 PA domain 对 BSAP 的催化能力的影响 | 第59-60页 |
| 4.3.6 BSAP 和 BSAP-ΔPA 在大豆蛋白水解实验中效果分析 | 第60-61页 |
| 4.4 本章小结 | 第61-62页 |
| 第五章 BSAP 生理功能研究 | 第62-73页 |
| 5.1 前言 | 第62页 |
| 5.2 材料与方法 | 第62-66页 |
| 5.2.1 菌株和质粒 | 第62-63页 |
| 5.2.2 试剂与仪器 | 第63页 |
| 5.2.3 培养基和培养条件 | 第63页 |
| 5.2.4 DNA 操作方法 | 第63-65页 |
| 5.2.5 分析方法 | 第65-66页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第66-72页 |
| 5.3.1 BS-AP-K 和 BS-AP-R 突变菌株的构建和鉴定 | 第66页 |
| 5.3.2 野生型和突变菌种在 LB 培养基和 SPM 中生长情况比较 | 第66-69页 |
| 5.3.3 不同温度下野生型和突变菌种在 SPM 中生长情况比较 | 第69-70页 |
| 5.3.4 野生型和突变菌种培养上清液中游离氨基酸和多肽分布的差异分析 | 第70-71页 |
| 5.3.5 游离氨基酸添加对野生型和 BS-AP-K 菌株在 SPM 中生长的影响 | 第71-72页 |
| 5.4 本章小结 | 第72-73页 |
| 主要结论与展望 | 第73-75页 |
| 主要结论 | 第73-74页 |
| 展望 | 第74-75页 |
| 论文创新点 | 第75-76页 |
| 致谢 | 第76-77页 |
| 参考文献 | 第77-86页 |
| 附录：作者在攻读博士学位期间发表的论文 | 第86页 |
