| 中文摘要 | 第3-7页 |
| Abstract | 第7-10页 |
| 缩略词表 | 第17-19页 |
| 第一章 文献综述 | 第19-39页 |
| 1 piRNAs与PIWI蛋白的研究进展 | 第19-26页 |
| 1.1 piRNAs的发现及作用机制 | 第19-21页 |
| 1.1.1 piRNAs的发现 | 第19-20页 |
| 1.1.2 piRNAs的生物发生 | 第20-21页 |
| 1.2 PIWI蛋白的发现 | 第21-22页 |
| 1.3 PIWI/piRNAs复合物的生物学功能 | 第22-26页 |
| 1.3.1 PIWI/piRNAs对性腺发育的功能 | 第22-24页 |
| 1.3.2 PIWI/piRNAs参与表观遗传调控 | 第24页 |
| 1.3.3 PIWI/piRNAs对于转座子沉默的作用 | 第24-25页 |
| 1.3.4 PIWI/piRNAs对mRNA翻译的调控 | 第25页 |
| 1.3.5 体细胞中PIWI/piRNAs的功能 | 第25-26页 |
| 2 基因编辑技术 | 第26-34页 |
| 2.1 CRISPR/Cas9技术的简介 | 第27页 |
| 2.2 CRISPR/Cas9系统的结构和组成 | 第27-29页 |
| 2.3 CRISPR/Cas9技术原理 | 第29-31页 |
| 2.4 CRISPR/Cas9技术的应用 | 第31-33页 |
| 2.4.1 CRISPR/Cas9在基因组编辑中的应用 | 第31-32页 |
| 2.4.2 CRISPR/Cas9对转录调控的作用 | 第32页 |
| 2.4.3 利用CRISPR/Cas9系统进行基因治疗 | 第32-33页 |
| 2.5 CRISPR/Cas9技术的脱靶问题 | 第33-34页 |
| 2.5.1 CRISPR/Cas9系统中PAM的选择 | 第33页 |
| 2.5.2 CRISPR/Cas9系统中gRNA的选择 | 第33-34页 |
| 2.6 CRISPR/Cas9技术的优缺点 | 第34页 |
| 3 高通量测序技术 | 第34-37页 |
| 3.1 测序技术的发展 | 第34-35页 |
| 3.1.1 DNA测序技术的出现 | 第34页 |
| 3.1.2 第一代测序技术 | 第34-35页 |
| 3.1.3 第二代测序技术 | 第35页 |
| 3.1.4 第三代测序技术 | 第35页 |
| 3.2 Illumina测序仪原理 | 第35-36页 |
| 3.3 llumina测序基本流程 | 第36-37页 |
| 3.3.1 文库制备 | 第36页 |
| 3.3.2 簇生成 | 第36页 |
| 3.3.3 边合成边测序 | 第36-37页 |
| 3.3.4 数据分析 | 第37页 |
| 4 本研究的目的与意义 | 第37-39页 |
| 第二章 不同阶段生殖系细胞中piRNAs表达与特性 | 第39-59页 |
| 1 引言 | 第39页 |
| 2 实验材料 | 第39-40页 |
| 2.1 实验动物 | 第39页 |
| 2.2 主要仪器与试剂 | 第39-40页 |
| 3 实验方法 | 第40-43页 |
| 3.1 不同阶段生殖干细胞及生精细胞的分离与鉴定 | 第40-42页 |
| 3.1.1 原始生殖细胞(PGCs)及精原干细胞(SSCs)的分离与鉴定 | 第40-42页 |
| 3.1.2 精原细胞的分离 | 第42页 |
| 3.1.3 成熟精子的获取与纯化 | 第42页 |
| 3.2 Small RNA cDNA文库的构建与深度测序 | 第42-43页 |
| 3.3 生物信息学分析 | 第43页 |
| 4 结果与分析 | 第43-56页 |
| 4.1 不同类型生殖系细胞的鉴定 | 第43-44页 |
| 4.2 样品质检结果 | 第44-45页 |
| 4.3 Small RNA深度测序数据概况 | 第45-50页 |
| 4.3.1 Small RNAs长度分析 | 第46-47页 |
| 4.3.2 Small RNA分类注释及碱基偏好性分析 | 第47-48页 |
| 4.3.3 不同生殖干细胞及生精细胞中piRNAs的来源分析 | 第48-50页 |
| 4.4 候选piRNAs的筛选 | 第50-56页 |
| 4.4.1 不同生殖干细胞及生精细胞的piRNAs分析 | 第50-53页 |
| 4.4.2 不同生殖干细胞及生精细胞的组间比较 | 第53-56页 |
| 5 讨论 | 第56-59页 |
| 第三章 鸡PIWI蛋白特异结合的piRNAs表达与分析 | 第59-72页 |
| 1 引言 | 第59页 |
| 2 实验材料 | 第59页 |
| 2.1 实验动物 | 第59页 |
| 2.2 主要仪器与试剂 | 第59页 |
| 3 实验方法 | 第59-62页 |
| 3.1 不同阶段生殖干细胞及生精细胞的分离 | 第59页 |
| 3.2 成熟精子的获取与纯化 | 第59页 |
| 3.3 免疫沉淀反应 | 第59-61页 |
| 3.4 Small RNA cDNA文库的构建与深度测序 | 第61页 |
| 3.5 生物信息学分析 | 第61-62页 |
| 4 结果与分析 | 第62-69页 |
| 4.1 样品质检结果 | 第62-63页 |
| 4.2 Small RNA深度测序数据概况 | 第63-66页 |
| 4.2.1 与PIWIL1蛋白结合的Small RNA长度分析 | 第64页 |
| 4.2.2 与PIWIL1蛋白结合的Small RNA分类注释 | 第64-65页 |
| 4.2.3 与PIWIL1蛋白结合的Small RNA碱基偏好性分析 | 第65页 |
| 4.2.4 与PIWIL1蛋白结合的piRNAs起源分析 | 第65-66页 |
| 4.3 候选piRNAs靶基因注释及GO、KEGG分析 | 第66-69页 |
| 4.3.1 不同生殖细胞中pRNAs的分析 | 第66-69页 |
| 5 讨论 | 第69-72页 |
| 第四章 候选piRNAs及其靶基因的验证 | 第72-80页 |
| 1 引言 | 第72页 |
| 2 实验材料 | 第72页 |
| 2.1 实验动物 | 第72页 |
| 2.2 主要仪器与试剂 | 第72页 |
| 3 实验方法 | 第72-75页 |
| 3.1 不同阶段生殖干细胞及生精细胞的分离与鉴定 | 第72-73页 |
| 3.2 总RNA提取 | 第73页 |
| 3.3 piRNA-19128与KIT基因靶向关系检测 | 第73-74页 |
| 3.3.1 DF-1的细胞培养 | 第73-74页 |
| 3.3.2 piRNA-19128 mimics与inh-bitor的转染 | 第74页 |
| 3.3.3 KIT基因野生型及突变型载体的构建 | 第74页 |
| 3.3.4 双荧光素酶实验 | 第74页 |
| 3.4 piRNA-19128与KIT基因靶向关系检测 | 第74页 |
| 3.5 RT-qPCR | 第74-75页 |
| 3.6 数据分析及处理 | 第75页 |
| 4 结果与分析 | 第75-78页 |
| 4.1 不同生殖干细胞中piRNA-19128及KIT基因表达量 | 第75-76页 |
| 4.2 piRNA-19128与KIT基因的靶向关系 | 第76-78页 |
| 5 讨论 | 第78-80页 |
| 第五章 Piwil1基因与piRNA在精子发生中减数分裂的作用 | 第80-90页 |
| 1 引言 | 第80页 |
| 2 实验材料 | 第80-81页 |
| 2.1 实验动物 | 第80页 |
| 2.2 主要仪器与试剂 | 第80-81页 |
| 3 实验方法 | 第81-83页 |
| 3.1 原始生殖细胞(PGCs)的分离与鉴定 | 第81页 |
| 3.2 RA诱导 | 第81页 |
| 3.3 PGCs诱导前后的流式分析 | 第81页 |
| 3.4 总RNA提取 | 第81页 |
| 3.5 Western Blot | 第81-83页 |
| 3.6 RT-qPCR | 第83页 |
| 3.7 数据分析及处理 | 第83页 |
| 4 结果与分析 | 第83-87页 |
| 4.1 PGCs细胞的分离与鉴定 | 第83-84页 |
| 4.2 RA促进PGCs进入减数分裂 | 第84-87页 |
| 4.2.1 RA诱导PGCs形态的变化 | 第84-85页 |
| 4.2.2 诱导过程中Piwil1基因mRNA的表达变化 | 第85-86页 |
| 4.2.3 诱导过程中PIWIL1蛋白水平的变化 | 第86-87页 |
| 5 讨论 | 第87-90页 |
| 第六章 敲除Piwil1基因后对精子发生的影响 | 第90-102页 |
| 1 引言 | 第90页 |
| 2 材料与方法 | 第90页 |
| 2.1 实验动物 | 第90页 |
| 2.2 主要仪器与试剂 | 第90页 |
| 3 实验方法 | 第90-94页 |
| 3.1 Piwil1基因CRISPR/Cas9敲除载体的构建 | 第90-91页 |
| 3.2 Cas9-Piwil1敲除载体活性验证 | 第91页 |
| 3.3 阳性单克隆细胞的挑选 | 第91-92页 |
| 3.4 鸡胚注射 | 第92-93页 |
| 3.4.1 敲除质粒-脂质体凝胶阻滞实验 | 第92页 |
| 3.4.2 转染液的配制及胚下腔注射 | 第92页 |
| 3.4.3 个体水平检测Cas9-Piwil1质粒敲除活性 | 第92页 |
| 3.4.4 鸡胚RNA水平检测敲除效率 | 第92页 |
| 3.4.5 敲除组体重检测 | 第92页 |
| 3.4.6 敲除组精液品质检测 | 第92-93页 |
| 3.4.7 出壳后敲除鸡群后续自交 | 第93页 |
| 3.5 数据统计及分析 | 第93-94页 |
| 4 结果 | 第94-100页 |
| 4.1 Cas9-Piwil1敲除载体的构建 | 第94页 |
| 4.2 Cas9-Piwil1敲除载体的活性验证 | 第94-95页 |
| 4.3 阳性细胞突变株的构建 | 第95-96页 |
| 4.4 5日龄与18日龄检测结果 | 第96-100页 |
| 4.4.1 5日龄与18日龄DNA水平敲除效率检测 | 第96-97页 |
| 4.4.2 5日龄与18日龄鸡胚RNA水平敲除效率检测 | 第97-98页 |
| 4.4.3 F_0代体重检测结果 | 第98页 |
| 4.4.4 F_0代敲除组精液品质检测 | 第98-100页 |
| 4.5 F_1代本交结果 | 第100页 |
| 5 讨论 | 第100-102页 |
| 全文结论 | 第102-103页 |
| 创新点 | 第103页 |
| 进一步工作设想 | 第103-104页 |
| 参考文献 | 第104-122页 |
| 附录 | 第122-127页 |
| 致谢 | 第127-128页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 | 第128-129页 |
