| 摘要 | 第4-5页 |
| abstract | 第5-6页 |
| 第一章 文献综述 | 第10-16页 |
| 1.1 苹果酸的理化性质 | 第10页 |
| 1.2 L-苹果酸的用途 | 第10-11页 |
| 1.3 苹果酸的化学合成法 | 第11页 |
| 1.4 苹果酸的生物合成法 | 第11-14页 |
| 1.4.1 苹果酸天然生产菌株 | 第11-12页 |
| 1.4.2 代谢工程菌株 | 第12-13页 |
| 1.4.3 两步发酵法产L-苹果酸的研究进展 | 第13-14页 |
| 1.5 选题背景和研究内容 | 第14-16页 |
| 1.5.1 苹果酸的应用前景 | 第14页 |
| 1.5.2 甘油及其利用 | 第14页 |
| 1.5.3 主要研究内容 | 第14-16页 |
| 第二章 材料与方法 | 第16-31页 |
| 2.1 实验材料 | 第16-20页 |
| 2.1.1 实验菌株和质粒 | 第16-17页 |
| 2.1.2 实验相关仪器 | 第17-18页 |
| 2.1.3 实验药品 | 第18-19页 |
| 2.1.4 溶剂和培养基配制 | 第19-20页 |
| 2.2 实验方法 | 第20-31页 |
| 2.2.1 引物设计和基因测序 | 第20-23页 |
| 2.2.1.1 PCR反应 | 第21页 |
| 2.2.1.2 融合PCR反应 | 第21-22页 |
| 2.2.1.3 菌落PCR反应 | 第22-23页 |
| 2.2.2 琼脂糖凝胶电泳 | 第23页 |
| 2.2.3 DNA片段的回收 | 第23-24页 |
| 2.2.4 PCR产物的纯化 | 第24页 |
| 2.2.5 DNA的酶切、去磷酸化和连接 | 第24-25页 |
| 2.2.6 大肠杆菌电转感受态细胞的制备与转化 | 第25-26页 |
| 2.2.7 大肠杆菌染色体DNA的提取 | 第26页 |
| 2.2.8 大肠杆菌质粒的提取 | 第26-27页 |
| 2.2.9 大肠杆菌基因的敲除 | 第27-28页 |
| 2.2.10 菌株的培养及发酵 | 第28-29页 |
| 2.2.10.1 菌体培养 | 第28页 |
| 2.2.10.2 发酵实验 | 第28-29页 |
| 2.2.11 葡萄糖的测定 | 第29页 |
| 2.2.12 发酵产物的测定 | 第29页 |
| 2.2.13 酶活的测定 | 第29-31页 |
| 2.2.13.1 细胞粗提液的制备 | 第29-30页 |
| 2.2.13.2 蛋白浓度的测定 | 第30页 |
| 2.2.13.3 苹果酸脱氢酶酶活测定 | 第30-31页 |
| 第三章 实验结果与讨论 | 第31-54页 |
| 3.1 好氧苹果酸生产菌株的构建 | 第31-38页 |
| 3.1.1 PEP羧化酶基因ppc启动子的置换 | 第32-33页 |
| 3.1.2 苹果酸酶maeA的敲除 | 第33-34页 |
| 3.1.3 苹果酸酶maeB的敲除 | 第34-35页 |
| 3.1.4 苹果酸脱氢酶mdh的敲除 | 第35-36页 |
| 3.1.5 苹果酸脱氢酶mqo的敲除 | 第36-37页 |
| 3.1.6 组合基因的敲除 | 第37-38页 |
| 3.1.7 三基因敲除菌株的构建 | 第38页 |
| 3.1.8 四基因敲除菌株的构建 | 第38页 |
| 3.2 苹果酸理论最大得率的计算 | 第38-39页 |
| 3.2.1 以甘油为底物生产苹果酸理论得率计算 | 第38-39页 |
| 3.2.2 以葡萄糖为底物生产苹果酸理论得率计算 | 第39页 |
| 3.3 工程菌株发酵结果分析 | 第39-54页 |
| 3.3.1 以甘油为底物进行发酵的结果 | 第39-40页 |
| 3.3.2 苹果酸脱氢酶mdh基因序列测定 | 第40-41页 |
| 3.3.3 苹果酸脱氢酶MDH的酶活力测定 | 第41页 |
| 3.3.4 羧化途径增强对苹果酸积累的影响 | 第41-47页 |
| 3.4.4.1 构建质粒pTrc-A-pck | 第42-43页 |
| 3.4.4.2 构建质粒pTrcppc | 第43-47页 |
| 3.3.5 以葡萄糖为底物进行发酵的结果 | 第47-54页 |
| 3.3.5.1 以葡萄糖为底物探究羧化途径增强对苹果酸积累的影响 | 第48-49页 |
| 3.3.5.2 苹果酸酶敲除和羧化途径增强的组合对苹果酸积累的影响 | 第49-52页 |
| 3.3.5.3 菌株 E21（p Trcpyc）的发酵优化实验 | 第52-54页 |
| 第四章 结论与展望 | 第54-56页 |
| 4.1 实验结论 | 第54-55页 |
| 4.2 展望 | 第55-56页 |
| 参考文献 | 第56-61页 |
| 发表论文和参加科研情况说明 | 第61-62页 |
| 发表的论文 | 第61页 |
| 参与的科研项目 | 第61-62页 |
| 致谢 | 第62-63页 |
