| 摘要 | 第3-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 第一章 研究背景 | 第12-21页 |
| 1.1 头孢菌素素C | 第12页 |
| 1.2 7 氨基头孢烷酸 | 第12-14页 |
| 1.3 头孢菌素C酰化酶 | 第14页 |
| 1.4 透明颤菌血红蛋白 | 第14-16页 |
| 1.5 提高CPCacy在宿主细胞中表达量的策略 | 第16-19页 |
| 1.5.1 对CPCacy的改造 | 第16-17页 |
| 1.5.2 载体的选择 | 第17-18页 |
| 1.5.3 宿主细胞的基因敲除 | 第18页 |
| 1.5.4 培养基条件优化 | 第18-19页 |
| 1.6 本研究的目的与内容 | 第19-21页 |
| 第二章 材料与方法 | 第21-41页 |
| 2.1 材料 | 第21-25页 |
| 2.1.1 基因 | 第21页 |
| 2.1.2 载体 | 第21页 |
| 2.1.3 菌株 | 第21页 |
| 2.1.4 培养基 | 第21-22页 |
| 2.1.5 常用试剂 | 第22-23页 |
| 2.1.6 酶与试剂盒 | 第23页 |
| 2.1.7 引物 | 第23-24页 |
| 2.1.8 仪器设备 | 第24-25页 |
| 2.2 实验方法 | 第25-41页 |
| 2.2.1 p ET-28a-CPCacy质粒和T-vgb质粒的提取 | 第25页 |
| 2.2.2 PCR扩增CPCacy基因和vgb基因 | 第25-26页 |
| 2.2.3 胶回收PCR产物 | 第26-27页 |
| 2.2.4 提取质粒pACYCDuet-1 和pETDuet-1 及pRSFDuet-1 | 第27页 |
| 2.2.5 双酶切质粒与基因 | 第27-28页 |
| 2.2.6 酶切产物的纯化与回收 | 第28页 |
| 2.2.7 质粒与基因连接 | 第28-29页 |
| 2.2.8 CaCl2转化法转化大肠杆菌DH5α | 第29页 |
| 2.2.9 转化子的鉴定和培养及重组质粒的提取 | 第29-30页 |
| 2.2.10 转化子的诱导表达 | 第30页 |
| 2.2.11 头孢菌素C酰化酶活性和生物量的检测 | 第30-32页 |
| 2.2.12 培养基成分对大肠杆菌表达CPCacy的影响 | 第32-34页 |
| 2.2.13 pH对大肠杆菌表达CPCacy的影响 | 第34页 |
| 2.2.14 P1噬菌体转导受体菌BL21(DE3) | 第34-35页 |
| 2.2.15 受体菌BL21(DE3)卡那霉素抗性基因的敲除 | 第35-37页 |
| 2.2.16 ptsG-型受体菌BL21(DE3)感受态细胞的制备 | 第37页 |
| 2.2.17 重组质粒转化ptsG+型BL21(DE3)和ptsG-型BL21(DE3) | 第37-38页 |
| 2.2.18 转化子的鉴定和培养及诱导表达 | 第38页 |
| 2.2.19 ptsG+型和ptsG-型工程菌酶活检测和生物量的测定 | 第38页 |
| 2.2.20 培养基碳源成分对酶活影响的研究 | 第38-39页 |
| 2.2.21 SDS-PAGE电泳分析单位菌落蛋白表达量 | 第39-40页 |
| 2.2.22 串联双CPCacy基因对酶活的影响研究 | 第40-41页 |
| 第三章 结果与分析 | 第41-69页 |
| 3.1 PCR扩增CPCacy基因和vgb基因 | 第41-42页 |
| 3.2 双酶切质粒与基因 | 第42页 |
| 3.3 质粒分别与基因连接 | 第42-45页 |
| 3.4 转化子的鉴定 | 第45-53页 |
| 3.4.1 转化子pACYCDuet1vgb | 第46-47页 |
| 3.4.2 转化子pRSFDuet1vgb | 第47-49页 |
| 3.4.3 转化子pETDuet1vgb | 第49页 |
| 3.4.4 转化子pRSFDuet1vgb-CPCacy和pACYCDuet1vgb-CPCacy | 第49-50页 |
| 3.4.5 转化子pACYCDuet1CPCacy | 第50-51页 |
| 3.4.6 转化子pETDuet1CPCacy | 第51-52页 |
| 3.4.7 转化子pRSFDuet1CPCacy | 第52-53页 |
| 3.5 酶活检测 | 第53页 |
| 3.6 培养基成分对大肠杆菌表达CPCacy的影响 | 第53-57页 |
| 3.6.1 牛肉膏浓度 | 第53-54页 |
| 3.6.2 甘油浓度 | 第54-55页 |
| 3.6.3 酵母提取物浓度 | 第55-56页 |
| 3.6.4 NaCl浓度 | 第56-57页 |
| 3.7 pH因素对大肠杆菌表达CPCacy的影响 | 第57页 |
| 3.8 P1噬菌体转导受体菌BL21(DE3) | 第57-58页 |
| 3.9 受体菌BL21(DE3)卡那霉素抗性基因的敲除 | 第58-63页 |
| 3.10 SDS-PAGE电泳分析单位菌密度蛋白表达量 | 第63-65页 |
| 3.11 串联双基因的转化子对CPCacy酶活的影响 | 第65-69页 |
| 3.11.1 串联双CPCacy基因表达载体的构建 | 第65-67页 |
| 3.11.2 串联双CPCacy基因的转化子鉴定 | 第67页 |
| 3.11.3 串联双CPCacy基因的表达载体对酶活的影响 | 第67-69页 |
| 第四章 讨论 | 第69-72页 |
| 4.1 vgb基因对酶活的影响 | 第69页 |
| 4.2 培养基成分优化 | 第69-70页 |
| 4.3 ptsG基因缺陷对酶活的影响 | 第70页 |
| 4.4 菌体导入vgb基因和菌体ptsG基因缺陷对酶活性的影响 | 第70-71页 |
| 4.5 创新点 | 第71-72页 |
| 结论 | 第72-73页 |
| 参考文献 | 第73-78页 |
| 致谢 | 第78-79页 |
| 攻读硕士学位期间的研究成果 | 第79页 |
