| 摘要 | 第9-12页 |
| ABSTRACT | 第12-14页 |
| 符号与缩略语说明 | 第15-16页 |
| 前言 | 第16-17页 |
| 第一部分 文献综述 苯胺类除草剂微生物降解研究进展 | 第17-53页 |
| 第一节 微生物降解异丙隆等取代脲类除草剂的研究进展 | 第17-28页 |
| 1 异丙隆等取代脲类除草剂简介 | 第17-18页 |
| 2 取代脲除草剂的环境污染及危害 | 第18-21页 |
| 2.1 取代脲类除草剂在环境中的去向 | 第18-20页 |
| 2.2 取代脲类除草剂残留污染的危害 | 第20-21页 |
| 3 取代脲类除草剂的微生物降解研究进展 | 第21-27页 |
| 3.1 土壤中取代脲类除草剂的降解 | 第21-23页 |
| 3.2 降解取代脲类除草剂的微生物资源 | 第23-24页 |
| 3.3 取代脲类除草剂在微生物中的代谢途径 | 第24-25页 |
| 3.4 取代脲类除草剂微生物降解过程中的协同代谢作用 | 第25-27页 |
| 3.5 与取代脲类除草剂代谢有关的酶和基因 | 第27页 |
| 4 取代脲类除草剂微生物降解研究及其污染环境生物修复中的问题 | 第27-28页 |
| 第二节 苯胺类除草剂敌稗的微生物降解研究进展 | 第28-32页 |
| 1 敌稗简介 | 第28-29页 |
| 1.1 敌稗的基本信息 | 第28-29页 |
| 1.2 敌稗的理化性质 | 第29页 |
| 1.3 敌稗的毒性 | 第29页 |
| 1.4 敌稗的作用 | 第29页 |
| 2 敌稗及其主要代谢产物对环境的污染及其危害 | 第29-30页 |
| 3 敌稗生物降解研究进展 | 第30-31页 |
| 3.1 敌稗在水稻中的降解 | 第30页 |
| 3.2 敌稗在土壤及微生物中的降解 | 第30-31页 |
| 4 敌稗微生物降解及其污染环境生物修复研究中的问题 | 第31-32页 |
| 第三节 苯胺类除草剂共同降解产物—苯胺类化合物的微生物降解研究进展 | 第32-40页 |
| 1 苯胺类化合物的环境危害 | 第32-33页 |
| 2 苯胺类化合物微生物降解研究进展 | 第33-40页 |
| 2.1 降解苯胺类化合物的微生物资源 | 第33-35页 |
| 2.2 苯胺及其衍生物微生物降解机理及途径 | 第35-37页 |
| 2.3 苯胺降解基因簇 | 第37-40页 |
| 参考文献 | 第40-53页 |
| 第二部分 实验部分 | 第53-157页 |
| 第一章 菌株Sphingobium sp.YBL2降解除草剂异丙隆的代谢途径分析 | 第53-75页 |
| 1 材料与方法 | 第53-57页 |
| 1.1 试剂与培养基 | 第53-54页 |
| 1.2 供试菌株 | 第54页 |
| 1.3 菌悬液制备 | 第54页 |
| 1.4 菌株Sphingobium sp. YBL2对IPU及其已报道代谢产物的降解 | 第54-55页 |
| 1.5 底物浓度的检测 | 第55页 |
| 1.6 菌株YBL2细胞的IPU诱导 | 第55页 |
| 1.7 菌株静息细胞的制备 | 第55-56页 |
| 1.8 YBL2静息细胞苯胺双加氧酶活力检测 | 第56页 |
| 1.9 菌株细胞粗酶液的制备 | 第56页 |
| 1.10 细胞粗酶液的邻苯二酚1,2-双加氧酶和2,3-双加氧酶活力检测 | 第56-57页 |
| 1.11 菌株YBL2降解IPU代谢产物制备 | 第57页 |
| 1.12 代谢产物HPLC检测 | 第57页 |
| 1.13 代谢产物的质谱检测分析 | 第57页 |
| 2 结果与分析 | 第57-67页 |
| 2.1 菌株YBL2对IPU的降解 | 第57-58页 |
| 2.2 菌株YBL2对IPU已报道代谢产物的降解 | 第58-60页 |
| 2.3 IPU诱导对菌株YBL2苯胺双加氧酶活力的影响 | 第60-62页 |
| 2.4 IPU诱导对菌株YBL2邻苯二酚1,2-和2,3-双加氧酶活力的影响 | 第62-64页 |
| 2.5 代谢产物HPLC分析 | 第64页 |
| 2.6 代谢产物MS/MS分析 | 第64-67页 |
| 3 讨论 | 第67-71页 |
| 本章小结 | 第71-72页 |
| 参考文献 | 第72-75页 |
| 第二章 菌株Sphingobium sp.YBL2中的苯胺降解基因簇的克隆与表达 | 第75-115页 |
| 第一节 菌株Sphingobium sp. YBL2基因组框架图测序 | 第76-87页 |
| 1 材料与方法 | 第76-81页 |
| 1.1 试剂与培养基 | 第76页 |
| 1.2 供试菌株 | 第76-77页 |
| 1.3 菌体制备 | 第77页 |
| 1.4 底物浓度检测 | 第77页 |
| 1.5 菌株基因组DNA提取 | 第77-78页 |
| 1.6 菌株质粒DNA提取 | 第78页 |
| 1.7 菌株基因组测序 | 第78-81页 |
| 2 结果与分析 | 第81-86页 |
| 2.1 菌株降解活性验证及菌体制备 | 第81-82页 |
| 2.2 菌株基因组DNA提取 | 第82-83页 |
| 2.3 菌株基因组DNA测序 | 第83-86页 |
| 3 讨论 | 第86-87页 |
| 第二节 苯胺类化合物降解新基因簇的克隆与序列分析 | 第87-101页 |
| 1 材料与方法 | 第87-90页 |
| 1.1 试剂与培养基 | 第87页 |
| 1.2 供试菌株 | 第87-88页 |
| 1.3 菌株培养条件 | 第88页 |
| 1.4 菌株Sphingobium sp. YBL2对苯胺的降解 | 第88页 |
| 1.5 目标基因簇查找及侧翼序列分析 | 第88-90页 |
| 2 结果与分析 | 第90-99页 |
| 2.1 菌株YBL2对苯胺的降解 | 第90-91页 |
| 2.2 苯胺降解基因簇的生物信息学预测 | 第91-92页 |
| 2.3 基因簇侧翼序列的SEFA-PCR扩增及分析 | 第92-99页 |
| 3 讨论 | 第99-101页 |
| 3.1 菌株YBL2降解苯胺代谢途径推测 | 第100-101页 |
| 3.2 基因簇进化过程比较分析 | 第101页 |
| 第三节 苯胺双加氧基因簇ADO在Pseudomonas putida KT2440中的异源表达 | 第101-111页 |
| 1 材料与方法 | 第101-105页 |
| 1.1 试剂与培养基 | 第101-102页 |
| 1.2 供试菌株和质粒 | 第102页 |
| 1.3 菌株培养条件 | 第102页 |
| 1.4 苯胺降解基因簇的PCR扩增 | 第102-104页 |
| 1.5 苯胺降解基因簇表达载体的构建 | 第104-105页 |
| 1.6 重组表达菌株52QB2440和52QR2440对苯胺类化合物的降解 | 第105页 |
| 1.7 表达菌株52QR2440对3,4-二氯苯胺降解产物的检测 | 第105页 |
| 2 结果与分析 | 第105-109页 |
| 2.1 表达载体构建 | 第105-107页 |
| 2.2 重组表达菌株对苯胺类化合物的降解 | 第107-109页 |
| 3 讨论 | 第109-111页 |
| 本章小结 | 第111-112页 |
| 参考文献 | 第112-115页 |
| 第三章 菌株Sphingomonas sp. Y57降解敌稗的代谢途径分析及相关基因的克隆与表达 | 第115-157页 |
| 第一节 菌株Sphingomonas sp.Y57降解敌稗的代谢途径研究 | 第115-130页 |
| 1 材料与方法 | 第115-119页 |
| 1.1 培养基与试剂 | 第115-116页 |
| 1.2 供试菌株 | 第116页 |
| 1.3 菌悬液制备 | 第116页 |
| 1.4 菌株对敌稗及3,4-DCA的降解 | 第116页 |
| 1.5 菌株对4,5-二氯邻苯二酚的降解 | 第116-117页 |
| 1.6 菌体量的测量 | 第117页 |
| 1.7 底物浓度分析方法 | 第117页 |
| 1.8 菌株降解敌稗和3,4-DCA代谢产物的提取及检测 | 第117-118页 |
| 1.9 菌株Y57苯胺双加氧酶基因簇扩增 | 第118-119页 |
| 1.10 菌株Y57邻苯二酚双加氧酶活力检测 | 第119页 |
| 2 结果与分析 | 第119-127页 |
| 2.1 菌株对敌稗及3,4-DCA的降解 | 第119-121页 |
| 2.2 菌株Y57降解3,4-DCA中间代谢产物的检测 | 第121-124页 |
| 2.3 菌株Y57对4,5-DCCAT的降解 | 第124-125页 |
| 2.4 菌株Y57苯胺双加氧酶基因簇片段扩增 | 第125-126页 |
| 2.5 菌株Y57细胞粗酶液邻苯二酚双加氧酶活力检测 | 第126-127页 |
| 3 讨论 | 第127-130页 |
| 第二节 菌株Sphingomonas sp. Y57中敌稗水解酶基因的克隆表达与酶学特性研究 | 第130-153页 |
| 1 材料与方法 | 第130-138页 |
| 1.1 培养基与试剂 | 第130页 |
| 1.2 供试菌株和质粒 | 第130-131页 |
| 1.3 菌株基因组文库构建 | 第131-133页 |
| 1.4 菌株基因组文库中阳性转化子筛选 | 第133页 |
| 1.5 阳性转化子外源插入片段测序分析 | 第133页 |
| 1.6 敌稗水解酶基因的亚克隆验证 | 第133-134页 |
| 1.7 敌稗水解酶基因序列分析 | 第134页 |
| 1.8 敌稗水解酶基因表达载体pET-prpH构建 | 第134-135页 |
| 1.9 表达载体pET-prpH转化BL21 (DE3)细胞 | 第135页 |
| 1.10 重组酶的诱导表达及SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析 | 第135-136页 |
| 1.11 敌稗水解重组酶酶学特性研究 | 第136-138页 |
| 1.11.1 酶液制备与纯化 | 第136-137页 |
| 1.11.2 蛋白含量的测定 | 第137页 |
| 1.11.3 蛋白纯度的测定 | 第137页 |
| 1.11.4 重组酶活性检测 | 第137页 |
| 1.11.5 重组酶催化敌稗水解进程曲线测定 | 第137页 |
| 1.11.6 环境条件对酶催化敌稗水解活力的影响 | 第137-138页 |
| 2 结果与分析 | 第138-152页 |
| 2.1 菌株基因组文库构建 | 第138-140页 |
| 2.2 菌株基因组文库中阳性转化子的筛选 | 第140-141页 |
| 2.3 阳性转化子外源插入片段测序分析 | 第141页 |
| 2.4 敌稗水解酶基因prpH序列分析 | 第141-144页 |
| 2.5 敌稗水解酶异源表达载体的构建 | 第144-146页 |
| 2.6 敌稗水解酶重组蛋白的诱导表达及SDS-PAGE分析 | 第146-147页 |
| 2.7 重组蛋白的亲和层析纯化及其敌稗水解酶活性检测 | 第147-149页 |
| 2.8 重组酶催化敌稗水解的进程曲线测定 | 第149页 |
| 2.9 环境条件对酶催化敌稗水解活力的影响 | 第149-152页 |
| 3 讨论 | 第152-153页 |
| 本章小结 | 第153-154页 |
| 参考文献 | 第154-157页 |
| 全文总结 | 第157-159页 |
| 主要创新点 | 第159-161页 |
| 附录 | 第161-165页 |
| 攻读博士学位期间发表或待发表的论文 | 第165-167页 |
| 致谢 | 第167页 |
