| 摘要 | 第1-8页 |
| ABSTRACT | 第8-13页 |
| 文献综述 | 第13-23页 |
| 第一章 轮状病毒及 NSP4 致病机理的研究进展 | 第13-23页 |
| ·轮状病毒的基本特性 | 第13-15页 |
| ·轮状病毒的结构 | 第13-14页 |
| ·轮状病毒的细胞培养特性 | 第14-15页 |
| ·轮状病毒的分类及流行病学特征 | 第15-16页 |
| ·轮状病毒抗原概述 | 第15页 |
| ·轮状病毒 VP4 和 VP7 血清型以及基因型 | 第15-16页 |
| ·轮状病毒的流行病学特征 | 第16页 |
| ·轮状病毒的基因组 | 第16-17页 |
| ·轮状病毒的基因组结构 | 第16-17页 |
| ·基因重配与种间传播 | 第17页 |
| ·轮状病毒的蛋白 | 第17-21页 |
| ·结构蛋白 | 第17-19页 |
| ·非结构蛋白 | 第19-21页 |
| ·NSP4 致病机理的研究进展 | 第21-23页 |
| 试验研究 | 第23-54页 |
| 第二章 猪 A 组轮状病毒实时荧光定量 PCR 检测方法的建立 | 第23-36页 |
| ·材料 | 第24-25页 |
| ·病毒、菌株、载体和细胞来源 | 第24页 |
| ·主要试剂 | 第24页 |
| ·主要仪器 | 第24-25页 |
| ·主要试剂的配制 | 第25页 |
| ·方法 | 第25-27页 |
| ·引物的设计与合成 | 第25页 |
| ·质粒标准品的制备与鉴定 | 第25-27页 |
| ·荧光定量 PCR 检测方法的建立 | 第27页 |
| ·荧光定量 PCR 与普通 RT-PCR 的比较 | 第27页 |
| ·PoRV 荧光定量 PCR 检测方法的初步应用 | 第27页 |
| ·结果 | 第27-33页 |
| ·PoRV VP6 基因的扩增及验证 | 第27-29页 |
| ·敏感性试验及标准曲线的建立 | 第29-30页 |
| ·熔解曲线的分析 | 第30页 |
| ·特异性试验 | 第30-31页 |
| ·重复性试验 | 第31-32页 |
| ·荧光定量 PCR 方法与普通 RT-PCR 方法的比较 | 第32-33页 |
| ·PoRV 感染 SIEC 不同时间点细胞内及上清液中病毒 VP6 基因拷贝数的检测结果 | 第33页 |
| ·讨论 | 第33-35页 |
| ·小结 | 第35-36页 |
| 第三章 真核表达载体 EGFP-NSP4 和 NSP4-EGFP 的构建与细胞转染及稳定表达细胞株的建立 | 第36-47页 |
| ·材料 | 第36-37页 |
| ·病毒、菌株、载体和细胞来源 | 第36-37页 |
| ·主要试剂 | 第37页 |
| ·主要仪器 | 第37页 |
| ·主要试剂的配制 | 第37页 |
| ·方法 | 第37-41页 |
| ·引物的设计与合成 | 第37-38页 |
| ·NSP4 基因的 PCR 扩增 | 第38-39页 |
| ·目的基因片段与载体的双酶切与回收 | 第39页 |
| ·目的基因片段与载体的连接与转化 | 第39-40页 |
| ·重组质粒的细胞转染与单克隆的筛选 | 第40-41页 |
| ·表达产物 mRNA 水平的 RT-PCR 鉴定 | 第41页 |
| ·结果 | 第41-44页 |
| ·NSP4 基因编码区的 PCR 扩增 | 第41页 |
| ·NSP4 基因菌液 PCR 初步鉴定结果 | 第41-42页 |
| ·重组质粒的双酶切以及测序鉴定 | 第42-43页 |
| ·重组质粒的细胞转染以及阳性细胞株的建立 | 第43-44页 |
| ·表达产物 mRNA 水平的 RT-PCR 鉴定结果 | 第44页 |
| ·讨论 | 第44-46页 |
| ·小结 | 第46-47页 |
| 第四章 猪轮状病毒非结构蛋白 NSP4 亚细胞定位的研究 | 第47-54页 |
| ·材料 | 第47-48页 |
| ·病毒、定位载体、重组质粒和细胞来源 | 第47页 |
| ·主要试剂 | 第47-48页 |
| ·主要仪器 | 第48页 |
| ·主要试剂的配制 | 第48页 |
| ·方法 | 第48-49页 |
| ·ZYM-SIEC02 的培养 | 第48页 |
| ·内质网定位载体 pDsred-ER 的转染 | 第48页 |
| ·稳定表达内质网定位载体细胞株的建立 | 第48-49页 |
| ·重组质粒转染稳定表达内质网定位载体的细胞株与 NSP4 亚细胞定位的观察 | 第49页 |
| ·NSP4 瞬时表达产物 mRNA 水平的 RT-PCR 鉴定 | 第49页 |
| ·结果 | 第49-52页 |
| ·内质网定位载体 pDsred-ER 的转染与稳定表达细胞株的建立 | 第49-50页 |
| ·PoRV NSP4 的亚细胞定位结果 | 第50-51页 |
| ·NSP4 瞬时表达产物 mRNA 水平的 RT-PCR 鉴定结果 | 第51-52页 |
| ·讨论 | 第52-53页 |
| ·小结 | 第53-54页 |
| 结论 | 第54-55页 |
| 参考文献 | 第55-64页 |
| 附录 | 第64-66页 |
| 缩略词 | 第66-67页 |
| 致谢 | 第67-69页 |
| 作者简介 | 第69页 |
