| 摘要 | 第1-7页 |
| ABSTRACT | 第7-11页 |
| 英文缩略表 | 第11-15页 |
| 第一章 文献综述 | 第15-23页 |
| 1. 布病病原体生物学特征 | 第15-16页 |
| 2. 细菌RNA分子伴侣HFQ蛋白的研究进展 | 第16-22页 |
| ·Hfq蛋白的结构特征 | 第16-17页 |
| ·Hfq蛋白功能的作用 | 第17-20页 |
| ·Hfq蛋白与细菌的毒力 | 第17页 |
| ·Hfq蛋白对毒力和分泌系统的调控 | 第17-18页 |
| ·Hfq蛋白对整体基因表达的调控 | 第18-19页 |
| ·Hfq调控机制的研究 | 第19-20页 |
| ·Hfq蛋白的靶标RNA研究方法 | 第20-22页 |
| 3. 研究的目的和意义 | 第22-23页 |
| 第二章 布鲁氏菌HFQ突变株、互补株的构建 | 第23-34页 |
| 1 实验材料 | 第23-24页 |
| ·菌株和质粒 | 第23页 |
| ·主要试剂 | 第23-24页 |
| ·主要仪器 | 第24页 |
| 2 实验方法 | 第24-27页 |
| ·引物设计与合成 | 第24-25页 |
| ·Hfq突变株的构建 | 第25-26页 |
| ·Hfq突变载体的构建 | 第25页 |
| ·布鲁氏菌16M感受态的制备和电转化 | 第25-26页 |
| ·Hfq突变株的筛选和鉴定 | 第26页 |
| ·Hfq互补株的构建 | 第26-27页 |
| ·互补载体的构建 | 第26-27页 |
| ·Hfq互补株的筛选及鉴定 | 第27页 |
| ·Hfq突变株和互补株的RT-PCR验证 | 第27页 |
| 3 实验结果 | 第27-32页 |
| ·Hfq突变株的构建 | 第27-29页 |
| ·Hfq突变载体的构建 | 第27-28页 |
| ·Hfq突变载体的PCR鉴定 | 第28-29页 |
| ·Hfq突变株的筛选 | 第29页 |
| ·Hfq突变株的鉴定 | 第29页 |
| ·互补株的构建 | 第29-32页 |
| ·pBBR1-Hfq互补质粒的构建及鉴定 | 第29-30页 |
| ·Hfq互补株的筛选 | 第30页 |
| ·Hfq互补株的鉴定 | 第30-32页 |
| ·Hfq突变株和互补株的RT-PCR验证 | 第32页 |
| 4 讨论 | 第32-34页 |
| ·利用pUC19K自杀载体质粒构建突变株 | 第32-33页 |
| ·利用pBBR1MCS-5质粒构建互补株 | 第33-34页 |
| 第三章 布鲁氏菌HFQ突变株、互补株的表型实验 | 第34-42页 |
| 1 实验材料 | 第34-35页 |
| ·主要试剂 | 第34页 |
| ·主要仪器 | 第34-35页 |
| 2 实验方法 | 第35-36页 |
| ·16M野生株、Hfq突变株和互补株的生长曲线 | 第35页 |
| ·16M野生株、Hfq突变株和互补株的体外应激实验 | 第35页 |
| ·16M野生株、Hfq突变株和互补株胞内生存实验 | 第35-36页 |
| ·16M野生株、Hfq突变株和互补株小鼠毒力实验 | 第36页 |
| 3 实验结果 | 第36-41页 |
| ·16M野生株、Hfq突变株和互补株的生长曲线 | 第36-37页 |
| ·16M野生株、Hfq突变株和互补株的体外应激实验 | 第37-38页 |
| ·16M野生株、Hfq突变株和互补株胞内生存实验 | 第38-39页 |
| ·16M野生株、Hfq突变株和互补株小鼠毒力实验 | 第39-41页 |
| 4 讨论 | 第41-42页 |
| ·Hfq调控了布鲁氏菌在刺激环境下的适应能力 | 第41页 |
| ·Hfq调控了布鲁氏菌在宿主细胞内生存能力和毒力 | 第41-42页 |
| 第四章 HFQ突变株和野生株的比较表达谱和蛋白质组分析 | 第42-79页 |
| 1 实验材料 | 第43-45页 |
| ·主要试剂 | 第43-44页 |
| ·主要仪器 | 第44-45页 |
| ·引物 | 第45页 |
| 2 实验方法 | 第45-53页 |
| ·Hfq高表达条件的确定 | 第45-46页 |
| ·不同培养条件下16M的RNA提取 | 第45-46页 |
| ·RNA用DNAse Ⅰ消化 | 第46页 |
| ·荧光定量PCR | 第46页 |
| ·16M与16M△hfq的基因芯片比较表达谱分析 | 第46-49页 |
| ·布鲁氏菌总RNA的提取 | 第46-47页 |
| ·逆转录生成氨基标记cDNA(间接标记) | 第47页 |
| ·氨基标记cDNA的纯化 | 第47-48页 |
| ·氨基标记cDNA的荧光素标记 | 第48页 |
| ·芯片杂交漂洗与扫描 | 第48-49页 |
| ·RT-PCR验证 | 第49页 |
| ·16M与16M△hfq的比较蛋白质组分析 | 第49-53页 |
| ·细菌全菌蛋白的制备 | 第50页 |
| ·双向电泳 | 第50-52页 |
| ·双向电泳胶内酶切 | 第52页 |
| ·数据库查询 | 第52-53页 |
| 3 实验结果 | 第53-73页 |
| ·Hfq高表达条件的确定 | 第53-54页 |
| ·16M和16M△hfq的比较表达谱分析 | 第54-67页 |
| ·Hfq对鞭毛基因的调控 | 第65-66页 |
| ·RT-PCR验证 | 第66-67页 |
| ·16M与16M△hfq的比较蛋白质组分析 | 第67-73页 |
| ·双向电泳结果 | 第67-69页 |
| ·质谱鉴定及结果查询 | 第69-73页 |
| 4 讨论 | 第73-79页 |
| ·Hfq对布鲁氏菌外膜蛋白的调控 | 第73-74页 |
| ·Hfq对布鲁氏菌sigma因子的调控 | 第74页 |
| ·Hfq对布鲁氏菌抵抗各种刺激条件相关基因蛋白的调控 | 第74-76页 |
| ·热刺激相关蛋白 | 第75页 |
| ·酸应激相关蛋白 | 第75-76页 |
| ·氧化应激相关蛋白 | 第76页 |
| ·渗透压应激相关蛋白 | 第76页 |
| ·Hfq对布鲁氏菌鞭毛蛋白的调控 | 第76-77页 |
| ·Hfq对布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统等毒力相关蛋白的调控 | 第77-78页 |
| ·Hfq对布鲁氏菌代谢、转运相关蛋白的调控 | 第78-79页 |
| 第五章 结论 | 第79-80页 |
| 参考文献 | 第80-85页 |
| 致谢 | 第85-87页 |
| 在读期间发表的学术论文 | 第87页 |
