| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-9页 |
| 目录 | 第9-15页 |
| 插图（表）清单 | 第15-18页 |
| 英文缩略词表 | 第18-22页 |
| 引言 | 第22-41页 |
| 1 猪腹泻与水肿病概况 | 第23-32页 |
| ·猪腹泻与水肿病现状 | 第23页 |
| ·猪腹泻与水肿病病原学基础 | 第23-25页 |
| ·肠毒素大肠杆菌 | 第24-25页 |
| ·猪流行性腹泻病毒 | 第25页 |
| ·猪腹泻与水肿病的免疫学与营养学调控基础 | 第25-26页 |
| ·主要抗性与功能基因 | 第26-32页 |
| ·ETEC 受体基因 | 第26-28页 |
| ·抗菌肽基因 | 第28-30页 |
| ·人溶菌酶基因 | 第30-32页 |
| 2 RNA 干扰技术与转基因育种研究概况 | 第32-37页 |
| ·RNA 干扰技术的发现 | 第32-34页 |
| ·RNA 干扰技术在畜禽哺乳类动物中的应用 | 第34-37页 |
| ·RNAi 在口蹄疫中的应用 | 第35页 |
| ·RNAi 在阮病毒中的应用 | 第35-36页 |
| ·RNAi 在抗流感中的应用 | 第36页 |
| ·RNAi 在其他疾病中的应用 | 第36页 |
| ·RNAi 在肉质改良中的的应用 | 第36-37页 |
| 3 转基因猪研究概况 | 第37-40页 |
| 4 研究的目的和意义 | 第40-41页 |
| 第一章 利用 RNA 干扰技术生产抗仔猪腹泻与水肿病转基因猪育种新材料的研究 | 第41-119页 |
| 引言 | 第41-43页 |
| 第一节 利用 CRE-LOXP 介导的多启动子 RNA 干扰猪 FUT1 基因生产转基因克隆猪胚胎 | 第43-65页 |
| 前言 | 第43-44页 |
| 材料与方法 | 第44-65页 |
| 1 实验材料 | 第44-50页 |
| ·实验仪器及耗材 | 第44-45页 |
| ·细胞与载体 | 第45页 |
| ·溶液配制与试剂 | 第45-49页 |
| ·引物合成和 DNA 测序 | 第49-50页 |
| 2 实验方法 | 第50-57页 |
| ·FUT1 基因多启动子 RNAi 干扰载体的构建 | 第50-53页 |
| ·FUT1 基因 RNAi 干扰载体靶点设计、合成和构建 | 第50页 |
| ·表达载体的线性化 | 第50页 |
| ·pGenesil1.1，pGenesil1.2，pGenesil1.3，pGenesil1.4 表达载体的构建 | 第50-51页 |
| ·FUT1 基因多启动子 RNAi 干扰载体的构建 | 第51-53页 |
| ·Cre-LoxP 介导的 FUT1 基因多启动子 RNAi 干扰载体的构建 | 第53页 |
| ·MCS-3s-LoxP-GFP 多功能全标记去除骨架载体的构建 | 第53页 |
| ·Cre-LoxP 介导的 FUT1 基因多启动子 RNAi 干扰载体的构建 | 第53页 |
| ·猪胎儿成纤维细胞培养和转基因稳定细胞系的建立 | 第53-56页 |
| ·猪胎儿成纤维细胞系的建立(组织块法) | 第53-54页 |
| ·猪胎儿成纤维转基因细胞系的建立 | 第54-55页 |
| ·猪胎儿成纤维细胞转基因细胞系目的基因整合检测 | 第55页 |
| ·Real-time PCR 对转基因稳定细胞系的检测 | 第55-56页 |
| ·卵母细胞的体外成熟 | 第56页 |
| ·体细胞核移植显微操作 | 第56-57页 |
| ·重构卵的融合与激活 | 第57页 |
| ·转基因胚胎的鉴定 | 第57页 |
| ·统计分析 | 第57页 |
| 3 结果与分析 | 第57-61页 |
| ·FUT1 基因多启动子 RNAi 干扰载体的构建 | 第57-58页 |
| ·Cre-LoxP 介导的 FUT1 基因多启动子 RNAi 干扰载体的构建 | 第58-59页 |
| ·猪胎儿成纤维转基因细胞系的建立与鉴定 | 第59-60页 |
| ·转基因克隆胚的构建与鉴定 | 第60-61页 |
| 4 讨论 | 第61-64页 |
| ·关于 RNAi 研究策略 | 第61-62页 |
| ·关于转基因动物生物安全 | 第62-64页 |
| 5 小结 | 第64-65页 |
| 第二节 慢病毒介导的 RNA 干扰猪 FUT1 基因生产转基因克隆猪 | 第65-119页 |
| 前言 | 第65-66页 |
| 材料与方法 | 第66-119页 |
| 1 实验材料 | 第66-69页 |
| ·实验仪器及耗材 | 第66-67页 |
| ·细胞、载体与菌株 | 第67页 |
| ·溶液配制与试剂 | 第67-68页 |
| ·引物合成和 DNA 测序 | 第68-69页 |
| 2 实验方法 | 第69-81页 |
| ·FUT1 基因 RNAi 干扰载体靶点设计、合成和构建 | 第69-70页 |
| ·siRNA 的设计 | 第69页 |
| ·双链 Oligo（ds oligo）的制备 | 第69-70页 |
| ·FUT1 基因 RNAi 干扰载体的构建 | 第70页 |
| ·FUT1 基因过表达载体的构建 | 第70-71页 |
| ·FUT1 基因的克隆 | 第70页 |
| ·pEGFP-N1-FUT1 表达载体的构建 | 第70-71页 |
| ·RNA 干扰有效靶点筛选 | 第71-72页 |
| ·RNA 干扰有效靶点 mRNA 水平的筛选 | 第71页 |
| ·RNA 干扰有效靶点蛋白水平的验证 | 第71-72页 |
| ·RNA 干扰有效靶点慢病毒表达载体的构建 | 第72-73页 |
| ·miR-3 靶点慢病毒载体的构建 | 第72页 |
| ·miR-1 靶点慢病毒载体的构建 | 第72-73页 |
| ·慢病毒包装和病毒滴度的测定 | 第73-74页 |
| ·慢病毒包装 | 第73页 |
| ·慢病毒滴度测定 | 第73-74页 |
| ·猪胎儿成纤维细胞培养和药物（Blasticidin）致死曲线的摸索 | 第74页 |
| ·猪胎儿成纤维细胞转基因细胞系的建立 | 第74-75页 |
| ·转基因细胞系整合与干扰效率检测 | 第75页 |
| ·转基因细胞系相关通路基因检测 | 第75-77页 |
| ·ELISA 检测转基因细胞上清液中干扰素和细胞因子应答反应 | 第77页 |
| ·卵母细胞的体外成熟 | 第77页 |
| ·体细胞核移植显微操作 | 第77页 |
| ·重构卵的融合与激活 | 第77页 |
| ·转基因核移植胚胎体外发育研究 | 第77-78页 |
| ·转基因核移植胚胎移植和妊娠检测 | 第78页 |
| ·转基因克隆猪的产生及鉴定 | 第78页 |
| ·转基因克隆猪耳缘成纤维细胞系的建立 | 第78-79页 |
| ·转基因猪相关基因组织表达谱检测 | 第79页 |
| ·转基因猪生理生化指标检测 | 第79页 |
| ·转基因猪相关免疫学指标检测 | 第79-80页 |
| ·转基因猪小肠上皮细胞体外黏附抑制 | 第80页 |
| ·猪小肠上皮细胞 IPEC-J2 转基因细胞系的建立 | 第80页 |
| ·猪小肠上皮细胞 IPEC-J2 转基因黏附检测 | 第80-81页 |
| ·统计分析 | 第81页 |
| 3 结果与分析 | 第81-113页 |
| ·FUT1 基因 RNAi 干扰载体和过表达载体的构建 | 第81-82页 |
| ·RNA 干扰有效靶点 mRNA 水平的筛选 | 第82-83页 |
| ·RNA 干扰有效靶点 mRNA 水平的筛选 | 第82-83页 |
| ·RNA 干扰有效靶点 mRNA 水平的筛选 | 第83页 |
| ·RNA 干扰有效靶点慢病毒的包转及病毒滴度测定 | 第83-84页 |
| ·猪胎儿成纤维转基因细胞系的建立 | 第84-85页 |
| ·转基因细胞整合鉴定 | 第85-86页 |
| ·猪胎儿成纤维转基因细胞干扰效率及凋亡基因检测 | 第86页 |
| ·猪胎儿成纤维转基因细胞相关通路基因表达检测 | 第86页 |
| ·猪胎儿成纤维转基因细胞上清液细胞因子及干扰素应答检测 | 第86-87页 |
| ·转基因克隆胚胎体外发育 | 第87-89页 |
| ·转基因克隆胚胎胚胎移植和产生 | 第89-90页 |
| ·转基因克隆猪的鉴定 | 第90-91页 |
| ·克隆猪耳成纤维细胞建系 | 第91页 |
| ·转基因猪相关生理生化指标检测 | 第91页 |
| ·转基因猪相关免疫学指标检测 | 第91-94页 |
| ·转基因猪相关基因组织表达谱检测 | 第94-110页 |
| ·转基因克隆猪小肠组织黏附实验 | 第110-111页 |
| ·猪小肠上皮细胞 IPEC-J2 转基因细胞系的建立 | 第111页 |
| ·猪小肠上皮细胞 IPEC-J2 转基因细胞系黏附实验 | 第111-113页 |
| 4 讨论 | 第113-118页 |
| ·RNAi 研究策略的选取 | 第113-115页 |
| ·有效靶点筛选策略 | 第113页 |
| ·RNAi 对照组的选取 | 第113-114页 |
| ·RNAi 效应的检测 | 第114页 |
| ·RNAi 系统的选择 | 第114-115页 |
| ·RNAi 中细胞来源的选择 | 第115页 |
| ·转基因细胞系质量评价 | 第115-116页 |
| ·核移植程序改进 | 第116页 |
| ·转基因克隆胚胎体外发育研究 | 第116页 |
| ·转基因猪抗病验证 | 第116-117页 |
| ·转基因猪免疫指标检测 | 第116-117页 |
| ·重组菌与仔猪小肠上皮细胞的体外黏附抑制试验 | 第117页 |
| ·F18 受体鉴定 | 第117-118页 |
| 5 小结 | 第118-119页 |
| 第二章 利用乳腺组织特异性表达技术生产抗仔猪腹泻与水肿病转基因猪育种新材料的研究 | 第119-148页 |
| 引言 | 第119-121页 |
| 第三节 乳腺特异性表达猪防御素转基因小鼠模型的建立 | 第121-129页 |
| 前言 | 第121页 |
| 材料与方法 | 第121-129页 |
| 1 实验材料 | 第121-122页 |
| ·实验仪器及耗材 | 第121页 |
| ·实验动物与载体 | 第121-122页 |
| ·溶液配制与试剂 | 第122页 |
| ·引物合成和 DNA 测序 | 第122页 |
| 2 实验方法 | 第122-125页 |
| ·pBD-1 基因片段的设计与合成 | 第122页 |
| ·pBD-1 基因乳腺特异性表达载体的构建 | 第122-123页 |
| ·pBD-1 基因乳腺特异性表达载体的提取与纯化 | 第123页 |
| ·转基因小鼠的制备 | 第123-125页 |
| ·Founder 转基因小鼠制备流程 | 第123-124页 |
| ·Founder 转基因小鼠鉴定 | 第124页 |
| ·F1~F2 代转基因鼠的产生与鉴定 | 第124页 |
| ·转基因小鼠表达鉴定 | 第124-125页 |
| 3 结果与分析 | 第125-127页 |
| ·pBD-1 基因乳腺特异性表达载体的鉴定 | 第125页 |
| ·pBD-1 基因乳腺特异性表达载体显微注射 DNA 片段的获取 | 第125页 |
| ·Founder 转基因小鼠鉴定 | 第125-126页 |
| ·pBD-1 基因的遗传检测 | 第126页 |
| ·pBD-1 基因的表达检测 | 第126-127页 |
| 4 讨论 | 第127-128页 |
| ·关于乳腺特异性表达载体的构建 | 第127-128页 |
| ·关于转基因小鼠的表达分析 | 第128页 |
| 5 小结 | 第128-129页 |
| 第四节 利用乳腺特异性表达人溶菌酶生产转基因猪克隆胎儿的研究 | 第129-140页 |
| 前言 | 第129页 |
| 材料与方法 | 第129-140页 |
| 1 实验材料 | 第129-130页 |
| ·实验仪器及耗材 | 第129-130页 |
| ·细胞、载体与菌株 | 第130页 |
| ·溶液配制与试剂 | 第130页 |
| ·引物合成和 DNA 测序 | 第130页 |
| 2 实验方法 | 第130-134页 |
| ·小鼠乳腺癌细胞株 C127 药物 G418 致死曲线的摸索 | 第130-131页 |
| ·小鼠乳腺癌细胞株 C127 的转染、筛选与整合鉴定 | 第131页 |
| ·外源激素诱导 hLYZ 在转基因细胞中的表达及浓缩 | 第131页 |
| ·hLYZ 在 C127 转基因细胞 mRNA 水平上的表达 | 第131-132页 |
| ·hLYZ 在 C127 转基因细胞重组蛋白的表达 | 第132-133页 |
| ·C127 转基因细胞上清液中重组人溶菌酶活性分析 | 第133页 |
| ·猪胎儿成纤维细胞转染 hLYZ 基因稳定细胞系的建立与鉴定 | 第133页 |
| ·卵母细胞的体外成熟 | 第133页 |
| ·体细胞核移植显微操作 | 第133页 |
| ·重构卵的融合与激活 | 第133页 |
| ·转基因胚胎胚胎移植 | 第133-134页 |
| 3 结果与分析 | 第134-137页 |
| ·乳腺表达载体的抽提及纯化 | 第134页 |
| ·小鼠乳腺癌细胞株 C127 的转染与整合鉴定 | 第134-135页 |
| ·RT-PCR 检测 hLYZ 基因在 C127 细胞中的表达 | 第135-136页 |
| ·Western blotting 检测目的蛋白在转基因细胞中的分泌 | 第136页 |
| ·重组人溶菌酶生物学活性检测 | 第136-137页 |
| ·转 hLYZ 猪胎儿成纤维转基因细胞稳定细胞系的建立与胚胎移植 | 第137页 |
| 4 讨论 | 第137-139页 |
| 5 小结 | 第139-140页 |
| 第五节 利用乳腺特异性表达猪防御素生产转基因猪克隆胚胎的研究 | 第140-148页 |
| 前言 | 第140-141页 |
| 材料与方法 | 第141-148页 |
| 1 实验材料 | 第141页 |
| ·实验仪器及耗材 | 第141页 |
| ·细胞与载体 | 第141页 |
| ·溶液配制与试剂 | 第141页 |
| ·引物合成和 DNA 测序 | 第141页 |
| 2 实验方法 | 第141-143页 |
| ·小鼠乳腺癌细胞株 C127 的转染、筛选与表达验证 | 第141-142页 |
| ·PBD-1 猪胎儿成纤维转基因细胞稳定细胞系的建立 | 第142页 |
| ·转 PBD-1 基因克隆胚的构建 | 第142-143页 |
| ·转 PBD-1 基因克隆胚的鉴定 | 第143页 |
| 3 结果与分析 | 第143-145页 |
| ·小鼠乳腺癌细胞株 C127 的转染与表达鉴定 | 第143-144页 |
| ·猪胎儿成纤维细胞转染 pBD-1 基因稳定细胞系的建立与鉴定 | 第144-145页 |
| ·转 pBD-1 基因克隆胚的构建与鉴定 | 第145页 |
| 4 讨论 | 第145-146页 |
| ·关于重组蛋白的检测和纯化 | 第145-146页 |
| ·关于乳腺特异性表达载体的构建 | 第146页 |
| 5 小结 | 第146-148页 |
| 结论 | 第148-149页 |
| 下一步工作设想 | 第149-150页 |
| 参考文献 | 第150-166页 |
| 附录 | 第166-176页 |
| 致谢 | 第176-178页 |
| 个人简介 | 第178-180页 |
