| 本论文的创新性工作 | 第1-5页 |
| 中文摘要 | 第5-8页 |
| ABSTRACT | 第8-11页 |
| 英文缩写词汇及其含义说明 | 第11-20页 |
| 第一部分 文献综述 | 第20-31页 |
| 第一章 疱疹病毒UL49基因及其编码蛋白研究进展 | 第20-31页 |
| 1. 疱疹病毒粒子的结构 | 第20-21页 |
| 2. 疱疹病毒的基因组结构 | 第21-22页 |
| 3. 疱疹病毒VP22蛋白翻译后修饰 | 第22-23页 |
| 4. 疱疹病毒VP22蛋白的亚细胞定位研究 | 第23-25页 |
| 5. 疱疹病毒VP22蛋白的转导功能 | 第25-27页 |
| 6. 疱疹病毒VP22蛋白缺失株表型 | 第27-28页 |
| 7. 疱疹病毒VP22蛋白与其他蛋白之间的相互作用 | 第28-30页 |
| 8. 鸭瘟病毒VP22蛋白功能研究进展 | 第30-31页 |
| 第二部分 试验研究 | 第31-156页 |
| 第二章 鸭瘟病毒UL49基因生物信息学分析 | 第31-51页 |
| 摘要 | 第31页 |
| 1. 试验材料 | 第31-32页 |
| ·DPV UL49基因核酸序列与氨基酸序列 | 第31-32页 |
| ·20株疱疹病毒UL49基因核酸序列 | 第32页 |
| 2. 试验方法 | 第32-33页 |
| 3. 试验结果 | 第33-43页 |
| ·DPV UL49基因相似性比较及进化树分析 | 第33-34页 |
| ·DPV VP22蛋白序列保守区域分析 | 第34-35页 |
| ·DPV VP22蛋白氨基酸组成 | 第35页 |
| ·DPV VP22蛋白的二级结构预测 | 第35页 |
| ·DPV VP22蛋白的信号肽预测 | 第35-36页 |
| ·DPV VP22蛋白的跨膜区预测 | 第36页 |
| ·DPV VP22蛋白功能位点预测 | 第36-37页 |
| ·DPV VP22蛋白抗原决定簇预测 | 第37页 |
| ·DPV VP22蛋白的滴定曲线预测 | 第37页 |
| ·DPV VP22蛋白亚细胞定位预测 | 第37-42页 |
| ·DPV VP22蛋白的核定位信号及核输出信号预测 | 第42页 |
| ·DPV VP22蛋白密码子偏嗜性分析 | 第42-43页 |
| 4. 讨论 | 第43-49页 |
| ·疱疹病毒分类及DPV的生物学归属 | 第43-46页 |
| ·DPV VP22蛋白的分子特性 | 第46-48页 |
| ·DPV VP22蛋白翻译后修饰 | 第48-49页 |
| ·DPV UL49基因密码子偏嗜性研究 | 第49页 |
| 5.小结 | 第49-50页 |
| Abstract | 第50-51页 |
| 第三章 鸭瘟病毒UL49基因克隆、原核表达、蛋白纯化及多克隆抗体制备 | 第51-79页 |
| 摘要 | 第51页 |
| 1. 试验材料 | 第51-57页 |
| ·质粒、菌株、毒株、抗体 | 第51-52页 |
| ·试验动物 | 第52页 |
| ·主要仪器设备 | 第52页 |
| ·主要试剂及配制 | 第52-57页 |
| ·主要试剂 | 第53页 |
| ·主要试剂配制 | 第53-57页 |
| 2. 试验方法 | 第57-67页 |
| ·DPV基因组DNA的提取 | 第57-58页 |
| ·DPV UL49基因的扩增与T克隆的构建 | 第58-61页 |
| ·DPV UL49基因引物设计 | 第58页 |
| ·DPV UL49基因的PCR扩增 | 第58-59页 |
| ·末端平滑DNA片段3'端加“A”反应 | 第59页 |
| ·A-Tailing DNA片段与pMD19-T Vector的连接 | 第59-60页 |
| ·DH5α高效率感受态细胞的制备 | 第60页 |
| ·DH5α感受态细胞的转化 | 第60页 |
| ·DPV UL49基因T克隆的鉴定 | 第60-61页 |
| ·重组原核表达质粒pET28a-UL49的构建与表达 | 第61-63页 |
| ·重组原核表达质粒pET28a-UL49的构建 | 第61-62页 |
| ·重组原核表达质粒pET28a-UL49的表达 | 第62-63页 |
| ·重组VP22蛋白的制备与纯化 | 第63-64页 |
| ·重组VP22蛋白的制备 | 第63-64页 |
| ·重组VP22蛋白的纯化 | 第64页 |
| ·重组VP22蛋白的超滤与冻干 | 第64页 |
| ·Western blot法检测重组VP22蛋白的反应原性 | 第64-65页 |
| ·兔抗重组VP22蛋白多克隆抗体的制备与纯化 | 第65-67页 |
| ·兔抗重组VP22蛋白多克隆抗体的制备 | 第65-66页 |
| ·兔抗重组VP22蛋白多克隆抗体的纯化 | 第66-67页 |
| ·Western blot法检测兔抗重组VP22蛋白多克隆抗体的特异性 | 第67页 |
| 3. 试验结果 | 第67-74页 |
| ·DPV UL49基因的扩增、T克隆及亚克隆的构建 | 第67页 |
| ·重组原核质粒pET28a-UL49的表达及表达条件优化 | 第67-71页 |
| ·重组原核质粒pET28a-UL49的表达 | 第67-69页 |
| ·重组原核质粒pET28a-UL49表达条件的优化 | 第69-71页 |
| ·重组VP22蛋白的纯化 | 第71页 |
| ·Western blot法检测重组VP22蛋白的反应原性 | 第71页 |
| ·兔抗重组VP22蛋白多克隆抗体的制备、纯化及特性 | 第71-74页 |
| ·琼脂双向扩散法检测兔抗重组VP22蛋白高免血清效价 | 第72-73页 |
| ·High Q阴离子交换层析法纯化兔抗VP22蛋白IgG | 第73页 |
| ·Western blot法检测兔抗重组VP22蛋白多克隆抗体的特异性 | 第73-74页 |
| 4. 讨论 | 第74-78页 |
| ·载体-宿主菌-培养条件最佳组合的确定 | 第74-76页 |
| ·重组VP22蛋白的可溶性表达 | 第76-77页 |
| ·重组VP22蛋白的纯化 | 第77-78页 |
| ·兔抗重组VP22蛋白的制备 | 第78页 |
| 5. 小结 | 第78-79页 |
| Abstract | 第79页 |
| 第四章 鸭瘟病毒VP22蛋白亚细胞定位研究 | 第79-94页 |
| 摘要 | 第80页 |
| 1. 试验材料 | 第80-81页 |
| ·毒株 | 第80页 |
| ·试验动物 | 第80页 |
| ·主要仪器设备 | 第80-81页 |
| ·主要试剂及配制 | 第81页 |
| ·主要试剂 | 第81页 |
| ·主要试剂配制 | 第81页 |
| 2. 试验方法 | 第81-83页 |
| ·间接免疫荧光法检测DPV VP22蛋白在病毒感染细胞中的定位 | 第81-83页 |
| ·间接免疫荧光法检测DPV VP22蛋白在病毒感染细胞中定位方法的建立 | 第81-82页 |
| ·间接免疫荧光法检测DPV VP22蛋白在病毒感染细胞中定位方法的条件优化 | 第82页 |
| ·特异性检测 | 第82-83页 |
| ·VP22重组蛋白能否由培养液自主进入细胞内部 | 第83页 |
| ·VP22重组蛋白能否由培养液自主进入细胞内检测方法的建立 | 第83页 |
| ·VP22重组蛋白能否由培养液自主进入细胞内检测方法的条件优化 | 第83页 |
| ·特异性检测 | 第83页 |
| 3. 试验结果 | 第83-90页 |
| ·间接免疫荧光法检测DPV VP22蛋白在病毒感染细胞中的定位 | 第84-85页 |
| ·间接免疫荧光法检测DPV VP22蛋白在病毒感染细胞中定位方法的条件优化 | 第84页 |
| ·特异性检测 | 第84页 |
| ·DPV VP22蛋白在病毒感染细胞中的定位时相 | 第84-85页 |
| ·VP22重组蛋白能否由培养液自主进入细胞内部 | 第85-90页 |
| ·VP22重组蛋白能否由培养液自主进入细胞内检测方法的条件优化 | 第85页 |
| ·特异性检测 | 第85页 |
| ·VP22重组蛋白能够由培养液自主进入细胞内部 | 第85-90页 |
| 4. 讨论 | 第90-93页 |
| ·疱疹病毒VP22蛋白在病毒感染细胞中的定位研究 | 第90-91页 |
| ·VP22重组蛋白能够由培养液自主进入细胞内部 | 第91-93页 |
| 5. 小结 | 第93页 |
| Abstract | 第93-94页 |
| 第五章 鸭瘟病毒UL49基因转录时相与表达时相分析 | 第94-110页 |
| 摘要 | 第94页 |
| 1. 试验材料 | 第94-96页 |
| ·试验动物、细胞及毒株 | 第94页 |
| ·主要仪器设备 | 第94-95页 |
| ·主要试剂及配制 | 第95-96页 |
| ·主要试剂 | 第95页 |
| ·试剂配制 | 第95页 |
| ·RNA试验器具的处理 | 第95-96页 |
| 2. 试验方法 | 第96-100页 |
| ·FQ-PCR法检测鸭瘟病毒体外感染宿主细胞UL49基因转录时相分析 | 第96-99页 |
| ·鸭胚成纤维细胞的培养与病毒接种 | 第96页 |
| ·Total RNA的抽提 | 第96-97页 |
| ·Total RNA中残存基因组DNA的去除与验证 | 第97页 |
| ·反转录反应 | 第97-98页 |
| ·FQ-PCR引物的设计与合成 | 第98页 |
| ·引物退火温度优化与特异性检测 | 第98页 |
| ·FQ-PCR标准曲线的建立 | 第98-99页 |
| ·DPV UL49基因转录时相分析 | 第99页 |
| ·DPV UL49基因在病毒感染DEF细胞中的表达时相分析 | 第99-100页 |
| ·鸭胚成纤维细胞的培养与病毒接种 | 第99页 |
| ·细胞总蛋白的提取 | 第99页 |
| ·SDS-PAGE分析 | 第99-100页 |
| ·Western-blot分析 | 第100页 |
| 3. 试验结果 | 第100-105页 |
| ·FQ-PCR法检测鸭瘟病毒体外感染宿主细胞UL49基因转录时相分析 | 第100-104页 |
| ·Total RNA完整度与纯度检测 | 第100-101页 |
| ·Total RNA中残存基因组DNA的去除与验证 | 第101页 |
| ·引物退火温度优化与特异性检测 | 第101页 |
| ·DPV UL49基因标准曲线的建立 | 第101-102页 |
| ·DPV UL49基因转录时相分析 | 第102-104页 |
| ·DPV UL49基因在病毒感染细胞中的表达时相分析 | 第104-105页 |
| 4. 讨论 | 第105-110页 |
| ·RNA质量控制与反转录 | 第105-107页 |
| ·FQ-PCR试验条件优化 | 第107-108页 |
| ·疱疹病毒UL49基因转录时相比较 | 第108-109页 |
| ·疱疹病毒UL49基因表达时相分析 | 第109-110页 |
| 5. 小结 | 第110页 |
| Abstract | 第110页 |
| 第六章 鸭瘟病毒VP22蛋白核定位信号研究 | 第110-129页 |
| 摘要 | 第111页 |
| 1. 试验材料 | 第111-113页 |
| ·质粒、菌株、毒株 | 第111页 |
| ·试验动物 | 第111页 |
| ·主要仪器设备 | 第111-112页 |
| ·主要试剂及配制 | 第112-113页 |
| ·主要试剂 | 第112-113页 |
| ·试剂配制 | 第113页 |
| 2. 试验方法 | 第113-116页 |
| ·DPV UL49全基因及其缺失突变体的引物设计 | 第113页 |
| ·DPV UL49全基因及其缺失突变体T克隆的构建 | 第113-114页 |
| ·DPV UL49全基因及其缺失突变体的扩增 | 第113页 |
| ·DPV UL49全基因及其缺失突变体T克隆的构建 | 第113页 |
| ·DPV UL49全基因及其缺失突变体T克隆的鉴定 | 第113-114页 |
| ·UL49全基因及其缺失突变体融合荧光质粒的构建 | 第114-115页 |
| ·DPV UL49全基因及其缺失突变体融合荧光质粒的制备 | 第115页 |
| ·DPV VP22蛋白及其缺失突变体在活细胞中的定位研究 | 第115页 |
| ·DPV VP22蛋白及其缺失突变体在甲醛固定细胞中的定位 | 第115-116页 |
| ·DPV VP22蛋白及其缺失突变体在不同固定剂处理细胞中的定位 | 第116页 |
| 3. 试验结果 | 第116-125页 |
| ·DPV UL49全基因及其缺失突变体的扩增 | 第116页 |
| ·DPV UL49全基因及其缺失突变体融合荧光质粒的构建与鉴定 | 第116-118页 |
| ·DPV VP22蛋白及其缺失突变体在活细胞中的定位研究 | 第118-121页 |
| ·VP22蛋白及其缺失突变体在甲醛固定细胞中的定位时相 | 第121-123页 |
| ·VP22蛋白及其缺失突变体在甲醇、乙醇、丙酮固定剂处理细胞中的定位 | 第123-125页 |
| 4. 讨论 | 第125-128页 |
| ·核定位信号的类型及研究意义 | 第125-126页 |
| ·核定位信号的研究方法 | 第126页 |
| ·DPV VP22蛋白核定位信号的确定 | 第126-127页 |
| ·疱疹病毒VP22蛋白核定位信号研究 | 第127-128页 |
| 5. 小结 | 第128页 |
| Abstract | 第128-129页 |
| 第七章 DPV UL49基因RNA干扰有效靶点筛选及其对病毒重要糖蛋白基因转录的影响 | 第129-156页 |
| 摘要 | 第129页 |
| 1. 试验材料 | 第129-131页 |
| ·试验动物、细胞、毒株、载体 | 第129-130页 |
| ·主要仪器设备 | 第130页 |
| ·主要试剂及配制 | 第130-131页 |
| ·主要试剂 | 第130-131页 |
| ·试剂配制 | 第131页 |
| 2. 试验方法 | 第131-134页 |
| ·靶向DPV UL49基因的RNAi重组真核质粒的构建 | 第131-132页 |
| ·靶向DPV UL49基因的shRNA设计与寡核苷酸合成 | 第131页 |
| ·shRNA模板的退火 | 第131页 |
| ·pGPU6 shRNA表达载体的线性化 | 第131-132页 |
| ·pGPU6 shRNA表达载体的构建 | 第132页 |
| ·DPV VP22全基因融合荧光表达质粒VP22a-GFP的构建及表达 | 第132-133页 |
| ·不同RNAi质粒对VP22a-GFP质粒荧光表达的抑制效率比较 | 第133页 |
| ·FQ-PCR法检测不同RNAi质粒对DPV UL49基因的转录抑制作用 | 第133页 |
| ·靶向DPV UL49基因的RNAi质粒VP22-505对病毒重要糖蛋白基因转录的影响 | 第133-134页 |
| 3. 试验结果 | 第134-148页 |
| ·shRNA的设计与寡核苷酸的合成 | 第134-136页 |
| ·pGPU6 shRNA重组质粒的鉴定 | 第136-137页 |
| ·不同重组RNAi质粒对VP22a-GFP质粒荧光表达的抑制效率比较 | 第137页 |
| ·FQ-PCR法检测4种RNAi质粒对DPV UL49基因转录的抑制作用 | 第137-139页 |
| ·FQ-PCR法检测RNAi质粒VP22-505对DPV UL49基因转录的影响 | 第139-142页 |
| ·DPV UL49基因及鸭β-actin基因标准曲线的构建 | 第139-141页 |
| ·FQ-PCR法检测RNAi质粒VP22-505对DPV UL49基因转录的影响 | 第141-142页 |
| ·FQ-PCR法检测RNAi质粒VP22-505对DPV gB基因转录的影响 | 第142-144页 |
| ·DPV gB基因标准曲线的构建 | 第142-144页 |
| ·FQ-PCR法检测RNAi质粒VP22-505对DPV gB基因转录的影响 | 第144页 |
| ·FQ-PCR法检测RNAi质粒VP22-505对DPV gD基因转录的影响 #]25 | 第144-146页 |
| ·DPV gD基因标准曲线的构建 | 第144-145页 |
| ·FQ-PCR法检测RNAi质粒VP22-505对DPV gD基因转录的影响 | 第145-146页 |
| ·FQ-PCR法检测RNAi质粒VP22-505对DPV gE基因转录的影响 | 第146-148页 |
| ·DPV gE基因标准曲线的构建 | 第146页 |
| ·FQ-PCR法检测RNAi质粒VP22-505对DPV gE基因转录的影响 | 第146-148页 |
| 4. 讨论 | 第148-155页 |
| ·RNAi研究的意义及作用机制 | 第148-150页 |
| ·靶向DPV UL49基因的shRNA序列的设计与RNAi质粒构建 | 第150-151页 |
| ·不同RNAi质粒对VP22a-GFP质粒荧光表达的抑制效率比较 | 第151页 |
| ·靶向DPV UL49基因的RNAi质粒对病毒重要糖蛋白基因转录的影响 | 第151-152页 |
| ·疱疹病毒VP22蛋白转录调控功能分析 | 第152-153页 |
| ·RNAi技术在疱疹病毒上的应用 | 第153-155页 |
| 5. 小结 | 第155页 |
| Abstract | 第155-156页 |
| 第三部分 结论 | 第156-158页 |
| 第四部分 参考文献 | 第158-179页 |
| 第五部分 致谢 | 第179-180页 |
| 第六部分 作者简介 | 第180页 |
