| 摘要 | 第1-7页 |
| ABSTRACT | 第7-12页 |
| 引言 | 第12-23页 |
| 1 草鱼呼肠孤病毒 | 第12-18页 |
| ·草鱼呼肠孤病毒的分类 | 第12-13页 |
| ·草鱼呼肠孤病毒的理化性质 | 第13页 |
| ·草鱼呼肠孤病毒的复制、转录和翻译机制及致病机理 | 第13-14页 |
| ·草鱼呼肠孤病毒核酸序列及编码蛋白 | 第14-15页 |
| ·GCRV-GD108 株 | 第15-18页 |
| 2 草鱼病毒性出血病疫苗研究进展 | 第18-19页 |
| ·GCRV 疫苗研究进展 | 第18页 |
| ·GCRV 基因工程亚单位疫苗研究进展 | 第18-19页 |
| ·GCRV 防治研究的新趋势 | 第19页 |
| 3 GCRV VP5 蛋白及 MRV 与 ARV 同源物的研究进展 | 第19-20页 |
| 4 原核表达系统 | 第20-22页 |
| ·不同表达系统的比较 | 第20-21页 |
| ·原核表达系统中的常用系统 | 第21-22页 |
| 5 NTPase 活性测定实验原理 | 第22页 |
| 6 本研究的目的与意义 | 第22-23页 |
| 第一章 草鱼 GCRV-GD108 株 VP5 表达载体构建及蛋白纯化 | 第23-46页 |
| 1 材料与方法 | 第23-39页 |
| ·宿主菌、质粒和酶 | 第23页 |
| ·主要试剂 | 第23-28页 |
| ·主要试剂盒 | 第23-24页 |
| ·常用缓冲液 | 第24-25页 |
| ·培养基 | 第25-26页 |
| ·蛋白 SDS-PAGE 用试剂 | 第26-27页 |
| ·蛋白纯化试剂 | 第27-28页 |
| ·Western blot 试剂 | 第28页 |
| ·软件分析 M5 基因序列 | 第28页 |
| ·M5 基因编码蛋白的抗原性分析 | 第28页 |
| ·目的基因的扩增及其克隆 | 第28-32页 |
| ·M5 基因 PCR 扩增 | 第28-29页 |
| ·PCR 扩增的琼脂糖凝胶检测及目的片段的回收 | 第29-30页 |
| ·大肠杆菌 DH5α感受态制备 | 第30页 |
| ·M5 基因改造克隆及转化 | 第30-31页 |
| ·菌液 PCR 检测克隆结果 | 第31-32页 |
| ·重组质粒 pET30c-M5 和 pColdⅡ-M5 的构建 | 第32-34页 |
| ·克隆质粒提取 | 第32-33页 |
| ·载体质粒提取 | 第33页 |
| ·质粒 pMD-19T-pET-M5 和 pET30c 的双酶切 | 第33页 |
| ·质粒 pMD-19T-pCold-M5 和 pColdⅡ的分步单酶切 | 第33-34页 |
| ·载体片段和目的基因片段的连接 | 第34页 |
| ·重组质粒和表达菌株的获得 | 第34-36页 |
| ·重组质粒的转化和鉴定 | 第34-35页 |
| ·两种重组质粒的提取 | 第35页 |
| ·表达菌株的获得 | 第35-36页 |
| ·重组蛋白的诱导表达条件优化 | 第36-37页 |
| ·基因工程菌的初步诱导表达 | 第36页 |
| ·宿主菌、培养基及诱导时间的优化 | 第36页 |
| ·诱导温度的优化 | 第36-37页 |
| ·诱导剂浓度的优化 | 第37页 |
| ·重组蛋白的大量表达、纯化及 Western Blot 分析 | 第37-39页 |
| ·重组蛋白包涵体复性 | 第37-38页 |
| ·镍亲和柱纯化重组 VP5 蛋白 | 第38页 |
| ·重组蛋白的变性、透析复性纯化 | 第38页 |
| ·纯化后重组蛋白的 Western blot | 第38-39页 |
| 2 结果与分析 | 第39-44页 |
| ·基因序列分析 | 第39-41页 |
| ·抗原性分析 | 第41-42页 |
| ·M5 基因克隆及原核表达载体的构建 | 第42-43页 |
| ·重组蛋白的诱导表达及条件优化 | 第43页 |
| ·重组蛋白的纯化 | 第43-44页 |
| 3 讨论 | 第44-46页 |
| 第二章 VP5 蛋白的 NTPase 活性及免疫原性分析 | 第46-59页 |
| 1 材料与方法 | 第46-53页 |
| ·材料，仪器 | 第46页 |
| ·实验所需试剂 | 第46-48页 |
| ·纯化 buffer | 第46-47页 |
| ·ATP 酶测定实验所需溶液 | 第47-48页 |
| ·ELISA 所用试剂 | 第48页 |
| ·蛋白纯化条件的确立 | 第48-49页 |
| ·免疫试验用重组 VP5 蛋白的纯化 | 第48页 |
| ·活性测定用重组 VP5 蛋白的纯化 | 第48-49页 |
| ·包涵体变性复性纯化 | 第49页 |
| ·重组 VP5 蛋白 ATPase 活性分析 | 第49-51页 |
| ·ATPase 试剂盒初步鉴定重组蛋白活性 | 第49-50页 |
| ·重组蛋白活性的影响因素 | 第50-51页 |
| ·重组蛋白的免疫保护试验 | 第51页 |
| ·Elisa 测定抗体效价 | 第51-52页 |
| ·荧光定量 PCR 测定草鱼头肾 RNA 拷贝数 | 第52-53页 |
| ·草鱼头肾总 RNA 的提取 | 第52页 |
| ·草鱼头肾总 RNA 的反转录 | 第52-53页 |
| ·荧光定量 PCR 测定草鱼 mRNA 水平 | 第53页 |
| 2 结果与分析 | 第53-57页 |
| ·重组蛋白纯化体系的筛选 | 第53-54页 |
| ·重组蛋白 ATPase 活性初步鉴定结果 | 第54页 |
| ·NTPase 活性影响因素实验结果 | 第54-55页 |
| ·免疫保护实验 | 第55页 |
| ·Elisa 分析草鱼血清抗体 | 第55-56页 |
| ·荧光定量 PCR 检测 IgM mRNA 水平 | 第56-57页 |
| 3 讨论 | 第57-59页 |
| 总结 | 第59-60页 |
| 参考文献 | 第60-66页 |
| 附录 A 缩略词表 | 第66-67页 |
| 附录 B 质粒图谱 | 第67-69页 |
| 附录 C 在读期间发表文章 | 第69-70页 |
| 致谢 | 第70页 |
