| 第一章 猪繁殖与呼吸综合征病毒分子生物学研究进展 | 第1-19页 |
| ·PRRSV 体外生长特点 | 第13-14页 |
| ·基因组组成 | 第14-15页 |
| ·PRRSV 欧洲型和北美型毒株间序列差异性 | 第15-16页 |
| ·结构蛋白 | 第16-17页 |
| ·病毒蛋白的抗原性 | 第17-18页 |
| ·感染性 CDNA 克隆 | 第18页 |
| ·结语 | 第18-19页 |
| 第二章 PRRSV ORF5 基因的克隆 | 第19-27页 |
| 1 材料及设备 | 第19页 |
| ·菌种及质粒 | 第19页 |
| ·主要仪器 | 第19页 |
| ·主要药品及试剂 | 第19页 |
| 2 方法 | 第19-23页 |
| ·PRRSV 毒株的分离 | 第19-20页 |
| ·设计引物 | 第19页 |
| ·RT-PCR 检测 | 第19-20页 |
| ·PRRSV 毒株的分离和增殖 | 第20页 |
| ·PRRSV ORF5 基因的克隆 | 第20-23页 |
| ·用于模板的 PRRSV 基因组 RNA 制备 | 第20页 |
| ·RT-PCR 反应扩增 ORF5 基因 | 第20-21页 |
| ·将 ORF5 基因克隆入质粒 pMD 18-T | 第21-23页 |
| 3 结果 | 第23-26页 |
| ·血清的 RT-PCR 检测 | 第23页 |
| ·PRRSV ORF5 基因的克隆及鉴定 | 第23-24页 |
| ·PRRSV ORF5 基因的 RT-PCR 扩增 | 第23页 |
| ·PRRSV ORF5 重组质粒 PMD-ORF5 的 PCR 鉴定 | 第23-24页 |
| ·PRRSV ORF5 重组质粒 pMD-ORF5 的酶切鉴定 | 第24页 |
| ·测序结果 | 第24-25页 |
| ·核苷酸序列的比较 | 第24-25页 |
| ·氨基酸序列的比较 | 第25页 |
| ·氨基酸序列分析 | 第25-26页 |
| 4 讨论 | 第26-27页 |
| 第三章 PRRSV ORF5 基因原核表达 | 第27-37页 |
| 1 材料及设备 | 第27页 |
| ·质粒及菌株 | 第27页 |
| ·药品及试剂 | 第27页 |
| ·仪器及设备 | 第27页 |
| 2 方法 | 第27-31页 |
| ·ORF5 PCR 产物的准备 | 第27-29页 |
| ·引物设计 | 第27-28页 |
| ·反应体系 | 第28页 |
| ·PCR 反应参数 | 第28页 |
| ·PCR 产物的鉴定 | 第28页 |
| ·PCR 产物的纯化 | 第28页 |
| ·PCR 产物的酶切 | 第28-29页 |
| ·PBAD/GⅢC 质粒的准备 | 第29-30页 |
| ·pBAD/gⅢC 质粒的转化 | 第29页 |
| ·pBAD/gⅢC 质粒的提取 | 第29页 |
| ·pBAD/gⅢC 质粒的单酶切鉴定 | 第29页 |
| ·pBAD/gⅢC 质粒的双酶切 | 第29-30页 |
| ·酶切产物的回收 | 第30页 |
| ·ORF5 基因克隆入 PBAD/GⅢC 载体 | 第30-31页 |
| ·连接反应 | 第30页 |
| ·转化 DH5α | 第30页 |
| ·阳性克隆的筛选和鉴定 | 第30-31页 |
| ·ORF5 的原核表达、检测 | 第31页 |
| ·TOP10 感受态细胞的制备 | 第31页 |
| ·转化 | 第31页 |
| ·ORF5-pBAD/gⅢC 的诱导表达 | 第31页 |
| ·表达产物的 SDS-PAGE 检测 | 第31页 |
| ·Western-blot 检测 | 第31页 |
| 3 结果 | 第31-33页 |
| ·重组质粒 ORF5-PBAD/GⅢC 的构建 | 第31-32页 |
| ·表达蛋白的 SDS-PAGE 结果 | 第32页 |
| ·表达蛋白的 WESTERN BLOT检测结果 | 第32-33页 |
| 4 讨论 | 第33-35页 |
| 5 附录 | 第35-37页 |
| ·质粒图谱: | 第35-36页 |
| ·技术路线 | 第36-37页 |
| 第四章 PRRSV ORF5 基因腺病毒表达载体的构建 | 第37-51页 |
| 1 材料与设备 | 第37页 |
| ·菌种、质粒及细胞系 | 第37页 |
| ·主要仪器 | 第37页 |
| ·主要药品及试剂 | 第37页 |
| 2 方法 | 第37-44页 |
| ·PRRSV ORF5 基因穿梭载体 PADTRACK-CMV-ORF5 的构建 | 第37-40页 |
| ·ORF5 PCR 产物的准备 | 第37-39页 |
| ·质粒 pAdTrack-CMV 的准备 | 第39页 |
| ·连接反应 | 第39页 |
| ·pAdTrack-CMV-ORF5 转化 DH5α | 第39-40页 |
| ·pAdEasy-1 和 pAdTrack-CMV-ORF5 进行同源重组 | 第40-42页 |
| ·将质粒pAdEasy-1转入大肠杆菌BJ5183 | 第40-41页 |
| ·将含质粒 pAdEasy-1 的 BJ5183 制成感受态细胞(CaCl2法) | 第41页 |
| ·穿梭载体 pAdTrack-CMV-ORF5 线形化及纯化 | 第41页 |
| ·线性化的 pAdTrack-CMV-ORF5 转化含 pAdEasy-1 的 BJ5183 进行同源重组 | 第41页 |
| ·同源重组腺病毒质粒 pAdCMV-ORF5 的鉴定 | 第41-42页 |
| ·重组腺病毒质粒 pAdCMV-ORF5 扩增及纯化 | 第42页 |
| ·重组质粒的转染 | 第42-43页 |
| ·重组腺病毒 pAdCMV-ORF5 的制备 | 第42页 |
| ·转染 293 细胞 | 第42-43页 |
| ·病毒的扩增 | 第43页 |
| ·重组腺病毒 pAdCMV-ORF5 的鉴定 | 第43-44页 |
| ·病毒 DNA 的制备 | 第43页 |
| ·pAdCMV-ORF5 用 ORF5 的引物扩增 | 第43-44页 |
| ·重组腺病毒 pAdCMV-ORF5 的荧光鉴定 | 第44页 |
| 3 结果 | 第44-47页 |
| ·腺病毒穿梭质粒 PADTRACK-CMV-ORF5 的构建和鉴定 | 第44页 |
| ·同源重组腺病毒质粒 PADCMV-ORF5 的构建及鉴定 | 第44-45页 |
| ·pAdEasy 的鉴定 | 第44-45页 |
| ·重组腺病毒质粒 pAdCMV、pAdCMV-ORF5 的鉴定 | 第45页 |
| ·重组腺病毒感染 293 细胞后表达产物的鉴定 | 第45-47页 |
| ·PCR 检测 | 第45-46页 |
| ·重组腺病毒对 293 细胞的细胞病变 | 第46页 |
| ·pAdCMV-ORF5 表达 ORF5 的荧光检测 | 第46-47页 |
| 4 讨论 | 第47-49页 |
| ·应用腺病毒表达系统表达外源基因的优点 | 第47页 |
| ·在 ADEASY腺病毒载体系统操作过程需注意的一些问题 | 第47-48页 |
| ·PRRSV GP5 的腺病毒表达 | 第48-49页 |
| 5 附录 | 第49-51页 |
| ·质粒图谱 | 第49页 |
| ·技术路线图 | 第49-51页 |
| 结 论 | 第51-52页 |
| 参考文献 | 第52-59页 |
