| 前言 | 第1-13页 |
| 1． 利用酵母双杂交筛选与 BclGs相互作用的分子 | 第13-28页 |
| 1．1 材料 | 第13页 |
| 1．2 方法 | 第13-20页 |
| 1．2．1 酵母的长期保存与复苏 | 第13页 |
| 1．2．2 逆转录反应 | 第13-15页 |
| 1．2．3 诱饵质粒pGBKT7-BclGs的构建及转化 | 第15-16页 |
| 1．2．4 验证有无自身转录激活活性 | 第16-18页 |
| 1．2．5 酵母蛋白的提取及鉴定 | 第18-19页 |
| 1．2．6 大规模文库质粒(pACT2-DNA)转化与文库筛选 | 第19页 |
| 1．2．7 用α-gal初步筛查阳性菌落 | 第19-20页 |
| 1．2．8 小剂量提取酵母质粒 | 第20页 |
| 1．2．9 PCR产物进行测序 | 第20页 |
| 1．2．10 连接到T载体上进行测序 | 第20页 |
| 1．3 结果 | 第20-25页 |
| 1．3．1 BclGs的分子结构分析 | 第20-21页 |
| 1．3．2 与BclGs相互作用的阳性克隆的获得 | 第21-22页 |
| 1．3．3 与 BclGs可能具有相互作用阳性克隆的鉴定(部分) | 第22-23页 |
| 1．3．4 测序结果的生物信息学初步分析 | 第23-25页 |
| 1．4 小结 | 第25-26页 |
| 参考文献 | 第26-28页 |
| 2． 酵母双杂交验证 BclGs与 JAB1的相互作用 | 第28-32页 |
| 2．1 材料与方法 | 第28-30页 |
| 2．1．1 材料 | 第28页 |
| 2．1．2 方法 | 第28-30页 |
| 2．1．2．1 酵母双杂交验证相互作用(共转化) | 第28-29页 |
| 2．1．2．2 液体测定β-gal活性(ONPG法) | 第29-30页 |
| 2．2 结果 | 第30-31页 |
| 2．3 小结 | 第31-32页 |
| 3． 利用体外转录翻译系统进行相互作用的体外结合验证 | 第32-34页 |
| 3．1 材料和方法 | 第32-33页 |
| 3．1．1 材料 | 第32页 |
| 3．1．2 方法 | 第32-33页 |
| 3．1．2．1 体外转录翻译合成 BclGs和JAB1 | 第32页 |
| 3．1．2．2 体外结合实验 | 第32-33页 |
| 3．2 结果(预实验) | 第33页 |
| 3．3 小结 | 第33-34页 |
| 4． BclGs与 JAB1的细胞内共定位 | 第34-39页 |
| 4．1 材料和方法 | 第34页 |
| 4．1．1 材料 | 第34页 |
| 4．1．2 方法 | 第34页 |
| 4．1．2．1 载体构建 | 第34页 |
| 4．1．2．2 细胞培养 | 第34页 |
| 4．1．2．3 共转染细胞 | 第34页 |
| 4．2 结果 | 第34-35页 |
| 4．2．1 BclGs与JAB1瞬时表达的定位结果 | 第34-35页 |
| 4．3 小结 | 第35-36页 |
| 4．4 讨论 | 第36-37页 |
| 参考文献 | 第37-39页 |
| 5． BclGs通过 JAB1抑制 AP-1转录活性及初步的信号转导机制 | 第39-51页 |
| 5．1 材料和方法 | 第39-40页 |
| 5．1．1 材料 | 第39页 |
| 5．1．2 方法 | 第39-40页 |
| 5．1．2．1 载体构建 | 第39页 |
| 5．1．2．2 Lipofectamine 2000转染方法 | 第39页 |
| 5．1．2．3 荧光素酶活性测定 | 第39-40页 |
| 5．2 BclGs降低 JAB1对转录因子 AP-1的激活作用 | 第40-41页 |
| 5．2．1 小结 | 第41页 |
| 5．3 JAB1反义核酸阻断BclGs对 AP-1转录活性的抑制 | 第41-42页 |
| 5．3．1 材料与方法:同前(不转染外源性JAB1) | 第41页 |
| 5．3．2 结果 | 第41-42页 |
| 5．3．3 小结 | 第42页 |
| 5．4 利用Western Blotting检测 BclGs通过JAB1介导的信号转导通路 | 第42-45页 |
| 5．4．1 材料与方法 | 第42页 |
| 5．4．1．1 材料 | 第42页 |
| 5．4．1．2 方法 | 第42页 |
| 5．4．1．2．1 转染方案与设计 | 第42页 |
| 5．4．1．2．2 Western blotting | 第42页 |
| 5．4．2 结果 | 第42-45页 |
| 5．5 讨论 | 第45-47页 |
| 5．6 总结 | 第47页 |
| 5．7 存在的问题 | 第47-48页 |
| 参考文献 | 第48-51页 |
| 附录1: BclGs的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备 | 第51-57页 |
| 1 材料与方法 | 第51-54页 |
| 1．1 材料 | 第51页 |
| 1．2 方法 | 第51-54页 |
| 1．2．1 原核表达载体的构建 | 第51页 |
| 1．2．2 pET28a+-BclGs融合蛋白的表达与纯化 | 第51-53页 |
| 1．2．2．1 pET28a+-BclGs融合蛋白表达 | 第51页 |
| 1．2．2．2 包涵体的获取 | 第51-52页 |
| 1．2．2．3 pET28a+-BclGs融合蛋白的纯化 | 第52页 |
| 1．2．2．4 pET28a+-BclGs融合蛋白的复性 | 第52-53页 |
| 1．2．3 SDS-PAGE凝胶电泳 | 第53页 |
| 1．2．4 多克隆抗体的制备 | 第53-54页 |
| 2 结果 | 第54-56页 |
| 2．1 pET28a+-BclGs的原核表达、包涵体的溶解与纯化 | 第54-56页 |
| 2．2 pET28a+-BclGs的原核表达包涵体的透析复性 | 第56页 |
| 2．3 多克隆抗体的获得 | 第56页 |
| 3 小结 | 第56-57页 |
| 附录2: 用兔 BclGs多抗检测诱导细胞凋亡发生时内源性 BclGs蛋白表达 | 第57-59页 |
| 1 材料与方法 | 第57-59页 |
| 1．1 材料 | 第57页 |
| 1．2 方法 | 第57页 |
| 1．2．1 细胞凋亡的诱导 | 第57页 |
| 1．2．1．1 去除血清诱导细胞凋亡 | 第57页 |
| 1．2．1．2 Fas多抗诱导细胞凋亡 | 第57页 |
| 1．2．2 细胞凋亡指标的检测 | 第57页 |
| 1．2．3 Western blotting蛋白印迹法 | 第57页 |
| 1．3 结果 | 第57-58页 |
| 1．3．1 撤除血清后检测 Jurkat细胞中内源性 BclGs的表达 | 第57-58页 |
| 1．3．2 流式细胞检测撤除血清后 Jurkat细胞的凋亡 | 第58页 |
| 1．4 小结 | 第58-59页 |
| 附录3: BclGs在真核细胞内的瞬时表达 | 第59-60页 |
| 1 材料与方法 | 第59页 |
| 1．1 材料 | 第59页 |
| 1．2 方法 | 第59页 |
| 1．2．1 载体构建 | 第59页 |
| 1．2．2 细胞培养与瞬时转染 | 第59页 |
| 1．2．3 SDS-PAGE和Western Blotting | 第59页 |
| 2 结果 | 第59页 |
| 3 小结 | 第59-60页 |
| 附录4: 利用 Tet on系统筛选 BclGs双稳定细胞株 | 第60-64页 |
| 1 材料与方法 | 第60-61页 |
| 1．1 材料 | 第60页 |
| 1．2 方法 | 第60-61页 |
| 1．2．1 载体构建 | 第60页 |
| 1．2．2 转染及筛选细胞双稳定细胞株 | 第60-61页 |
| 1．2．3 细胞凋亡的功能实验 | 第61页 |
| 2 结果 | 第61-63页 |
| 2．1 利用外部和内部酶切位点EcoR I进行酶切的电泳图谱 | 第61-62页 |
| 2．2 RT-PCR | 第62页 |
| 2．3 流式细胞的分析 | 第62-63页 |
| 3 小结 | 第63-64页 |
| 附录5: 主要仪器设备和主要试剂的配制 | 第64-67页 |
| 1 主要仪器设备 | 第64页 |
| 2 主要溶液的配制 | 第64-67页 |
| 2．1 western-blot相关试剂 | 第64-65页 |
| 2．2 蛋白提取相关溶液 | 第65页 |
| 2．3 细胞培养相关溶液 | 第65-66页 |
| 2．4 酵母双杂交实验有关试剂 | 第66页 |
| 2．5 双报告基因实验 | 第66页 |
| 2．6 体外转录翻译实验 | 第66-67页 |
| 致谢 | 第67-68页 |
| 博士后期间发表的文章和学术论著 | 第68-70页 |
| 综述 | 第70-75页 |
