| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-12页 |
| 第一章 引言 | 第12-26页 |
| ·细胞能量平衡与疾病 | 第12-13页 |
| ·AMPK在细胞能量调控中的研究进展 | 第13-24页 |
| ·AMPK的发现 | 第13页 |
| ·AMPK参与调控的代谢途径 | 第13-14页 |
| ·参与AMPK调控的激酶及磷酸酶 | 第14-15页 |
| ·AMPK的亚基组成 | 第15-17页 |
| ·AMPK的亚基结构 | 第17-21页 |
| ·全长AMPK的结构信息 | 第21-24页 |
| ·AMPK发挥功能的条件 | 第24页 |
| ·小结 | 第24-26页 |
| 第二章 全长及删截突变体AMPK蛋白的表达和纯化 | 第26-42页 |
| ·表达载体的构建及目的蛋白的纯化 | 第26页 |
| ·表达载体的构建(略) | 第26页 |
| ·AMPK的表达和纯化 | 第26页 |
| ·全长AMPK结构及功能状态的检测 | 第26-28页 |
| ·全长AMPK翻译后修饰的检测 | 第28-41页 |
| ·小结 | 第41-42页 |
| 第三章 全长AMPK寡聚现象及寡聚条件的摸索 | 第42-63页 |
| ·实验方法 | 第42-52页 |
| ·负染色技术概述 | 第42-49页 |
| ·负染原理 | 第42-43页 |
| ·负染剂 | 第43-44页 |
| ·特性 | 第43页 |
| ·种类 | 第43-44页 |
| ·样品载网的准备及支持膜的制备 | 第44-46页 |
| ·载网的种类及规格 | 第44-45页 |
| ·载网的处理 | 第45页 |
| ·支持膜的制备 | 第45-46页 |
| ·负染制样方法和注意事项 | 第46-49页 |
| ·前期准备 | 第46-47页 |
| ·制样方法及流程 | 第47-48页 |
| ·注意事项 | 第48页 |
| ·影响负染效果的因素 | 第48-49页 |
| ·透射电镜观察概述 | 第49-52页 |
| ·透射电镜简介 | 第49页 |
| ·透射电镜观察样品前的调试 | 第49-52页 |
| ·全长AMPK负染样品的电镜观察 | 第52-53页 |
| ·全长AMPK寡聚条件的摸索 | 第53-58页 |
| ·pH值因素 | 第53-55页 |
| ·盐浓度因素 | 第55-57页 |
| ·蛋白浓度因素 | 第57-58页 |
| ·不改变缓冲液浓缩蛋白 | 第57-58页 |
| ·优化缓冲液浓缩蛋白 | 第58页 |
| ·制备用于电镜三维重构的AMPK寡聚体 | 第58-61页 |
| ·寡聚体的分离纯化 | 第58-59页 |
| ·寡聚体结构的稳定性 | 第59-60页 |
| ·寡聚体酶活的稳定性 | 第60-61页 |
| ·小结 | 第61-63页 |
| 第四章 电镜单颗粒技术重构AMPK不同状态下的三维结构 | 第63-83页 |
| ·实验方法 | 第63-67页 |
| ·电镜三维重构技术 | 第63-65页 |
| ·电子断层成像技术 | 第63页 |
| ·电子晶体学 | 第63-64页 |
| ·单颗粒技术 | 第64-65页 |
| ·小结 | 第65页 |
| ·单颗粒三维重构技术简介 | 第65-66页 |
| ·原理 | 第65页 |
| ·根据样品取向特点的两种重构策略 | 第65-66页 |
| ·电镜最佳工作状态的调试 | 第66页 |
| ·常规数据处理流程 | 第66-67页 |
| ·不同功能状态下AMPK负染样品的制备 | 第67-69页 |
| ·实验数据的收集 | 第69-70页 |
| ·实验数据的处理 | 第70-74页 |
| ·实验结果及分析 | 第74-83页 |
| ·二维类平均图 | 第74页 |
| ·对称性分析 | 第74-78页 |
| ·单体结构与已有文献报导的一致性 | 第78-79页 |
| ·全长AMPK三聚体在基态及配体结合状态下的三维结构模型 | 第79-83页 |
| 第五章 全长AMPK亚基构架的确定 | 第83-97页 |
| ·用于拟合的晶体结构序列分析 | 第83-88页 |
| ·删截突变体实验对KD、GBD的定位 | 第88-90页 |
| ·SITUS软件对其他亚基的定位分析 | 第90-92页 |
| ·KD-AID的计算拟合 | 第91页 |
| ·异三聚体核心复合物的计算拟合 | 第91-92页 |
| ·电子密度特征分析对各亚基的进一步定位 | 第92-97页 |
| ·KD-AID的进一步定位 | 第92-93页 |
| ·异三聚体核心的进一步定位 | 第93-95页 |
| ·GBD对差减后密度的拟合 | 第95-97页 |
| 第六章 腺苷结合诱导的AMPK的变构效应 | 第97-103页 |
| ·腺苷结合模型的比较及对变构机制的推测 | 第97-101页 |
| ·AMPK+ATP与AMPK基态模型的比较 | 第101-102页 |
| ·三态模型的提出 | 第102-103页 |
| 第七章 AMPK三聚体的寡聚分析 | 第103-107页 |
| ·表面静电势能分析 | 第103-104页 |
| ·可能存在相互作用的氨基酸 | 第104-107页 |
| 第八章 关于最新发表的晶体结构的讨论 | 第107-111页 |
| ·2Y94.PDB的结构特征 | 第107-109页 |
| ·晶体结构与电镜结构的差异 | 第109页 |
| ·小结 | 第109-111页 |
| 参考文献 | 第111-117页 |
| 附录 | 第117-140页 |
| 1.蛋白激酶的结构特征以及发挥功能时的构象变化 | 第117-119页 |
| 2.三种常用的负染剂 | 第119页 |
| 3.连续性碳膜的制备 | 第119-121页 |
| 4.负染色失败的典型示例 | 第121-123页 |
| 5.透射电子显微镜(TEM)结构 | 第123-124页 |
| 6.透射电子显微镜(TEM)成像原理 | 第124-125页 |
| 7.FEI TECNAI G20TEM的一般操作流程及注意事项 | 第125-127页 |
| 8.LOW DOSE简介 | 第127-128页 |
| 9.三维重构的数学理论基础 | 第128-129页 |
| 10.冲洗底片的注意事项 | 第129-131页 |
| 11.有分析价值的电镜照片的质量评估 | 第131-132页 |
| ·Y94.pdb在电镜结构中的拟合 | 第132-140页 |
| 在学期间的研究成果 | 第140-141页 |
| 致谢 | 第141页 |
