| 摘要 | 第3-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 第一章 文献综述 | 第12-26页 |
| 1.1 肝素 | 第12-13页 |
| 1.2 肝素前体以及大肠杆菌K5产肝素前体 | 第13-14页 |
| 1.3 酶学方法对heparosan进行硫酸化修饰 | 第14-15页 |
| 1.4 芳香磺基转移酶Ⅳ | 第15页 |
| 1.5 低分子量肝素 | 第15-16页 |
| 1.6 △4,5不饱和葡萄糖醛酸酶 | 第16-19页 |
| 1.6.1 肝素/硫酸乙酰肝素△4,5不饱和葡萄糖醛酸酶 | 第16-17页 |
| 1.6.2 Bacillus sp. GL1不饱和葡萄糖醛酸酶 | 第17-18页 |
| 1.6.3 糖苷水解酶家族 88 (glycoside hydrolase family 88) | 第18-19页 |
| 1.6.4 其它的糖苷水解酶家族 | 第19页 |
| 1.7 本课题的研究内容 | 第19-21页 |
| 参考文献 | 第21-26页 |
| 第二章 芳香磺基转移酶Ⅳ的表达及纯化 | 第26-39页 |
| 2.1 前言 | 第26页 |
| 2.2 实验材料 | 第26-30页 |
| 2.2.1 菌株 | 第26页 |
| 2.2.2 实验药品 | 第26-28页 |
| 2.2.3 培养基及缓冲液 | 第28-29页 |
| 2.2.4 主要实验仪器 | 第29-30页 |
| 2.3 实验方法 | 第30-34页 |
| 2.3.1 AST-Ⅳ工程菌的诱导表达 | 第30页 |
| 2.3.2 AST-Ⅳ粗酶的收获 | 第30页 |
| 2.3.3 SDS-PAGE电泳检验 | 第30-31页 |
| 2.3.4 酶的分离、纯化与电泳鉴定 | 第31-32页 |
| 2.3.5 蛋白含量测定 | 第32-33页 |
| 2.3.6 AT-Ⅳ酶活的测定 | 第33-34页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第34-37页 |
| 2.4.1 AST-Ⅳ的诱导表达 | 第34-35页 |
| 2.4.2 AST-Ⅳ的分离、纯化与酶活测定 | 第35-37页 |
| 2.5 小结 | 第37-38页 |
| 参考文献 | 第38-39页 |
| 第三章 △4,5不饱和葡萄糖醛酸酶基因的克隆 | 第39-56页 |
| 3.1 前言 | 第39-40页 |
| 3.2 实验材料 | 第40-44页 |
| 3.2.1 菌株和质粒 | 第40页 |
| 3.2.2 培养基 | 第40页 |
| 3.2.3 生物化学试剂,酶及试剂盒 | 第40-42页 |
| 3.2.4 实验仪器 | 第42-43页 |
| 3.2.5 PCR引物 | 第43-44页 |
| 3.3 实验方法 | 第44-49页 |
| 3.3.1 肝素黄杆菌基因组DNA的提取 | 第44-45页 |
| 3.3.2 肝素黄杆菌中△4,5不饱和葡萄糖醛酸酶基因PCR扩增 | 第45页 |
| 3.3.3 PCR产物目的片段的回收 | 第45-46页 |
| 3.3.4 目的片段与T载体的连接 | 第46页 |
| 3.3.5 大肠杆菌E. coli DH5α感受态的制备 | 第46-47页 |
| 3.3.6 目的基因的转化 | 第47页 |
| 3.3.7 阳性克隆的筛选 | 第47-48页 |
| 3.3.8 菌落PCR验证 | 第48页 |
| 3.3.9 克隆质粒的提取 | 第48-49页 |
| 3.3.10 目的片段的测序及序列分析 | 第49页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第49-54页 |
| 3.4.1 △4,5不饱和葡萄糖醛酸酶基因的PCR扩增 | 第49-50页 |
| 3.4.2 目的基因的克隆 | 第50-51页 |
| 3.4.3 目的基因的序列分析 | 第51-54页 |
| 3.5 小结 | 第54-55页 |
| 参考文献 | 第55-56页 |
| 第四章 △4,5不饱和葡萄糖醛酸酶的表达 | 第56-75页 |
| 4.1 前言 | 第56-57页 |
| 4.2 实验材料 | 第57-62页 |
| 4.2.1 菌种和质粒 | 第57-58页 |
| 4.2.2 培养基、工具酶及试剂 | 第58-61页 |
| 4.2.3 Amylose Resin柱层析缓冲液 | 第61页 |
| 4.2.4 实验仪器 | 第61-62页 |
| 4.3 实验方法 | 第62-67页 |
| 4.3.1 质粒DNA的提取 | 第62页 |
| 4.3.2 PCR反应 | 第62页 |
| 4.3.3 双酶切反应 | 第62页 |
| 4.3.4 酶切产物的回收 | 第62页 |
| 4.3.5 重组表达载体pMAL-c2X-△4,5和pMAL-c2X-△4,5~(△20)的构建 | 第62-63页 |
| 4.3.6 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第63页 |
| 4.3.7 目的基因的转化 | 第63页 |
| 4.3.8 阳性克隆的筛选与鉴定 | 第63页 |
| 4.3.9 目的片段的测序 | 第63页 |
| 4.3.10 重组菌E. coli TB1/pMAL-c2X-△4,5和E. coli TB1/pMAL-c2X-△4,5~(△20)的诱导表达 | 第63-64页 |
| 4.3.11 表达产物SDS-PAGE分析 | 第64页 |
| 4.3.12 重组融合蛋白的纯化和结果分析 | 第64-65页 |
| 4.3.13 Bradford法测定蛋白含量 | 第65页 |
| 4.3.14 重组蛋白MBP-△4,5和MBP-△4,5~(△20)酶活力的检测 | 第65-67页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第67-74页 |
| 4.4.1 重组载体pMAL-c2X-△4,5和pMAL-c2X-△4,5~(△20)的构建 | 第67页 |
| 4.4.2 重组表达质粒的PCR鉴定 | 第67-68页 |
| 4.4.3 重组菌E. coli TB1/ pMAL-c2X-△4,5和E. coli TB1/pMAL-c2X-△4,5~(△20)的诱导表达 | 第68-71页 |
| 4.4.4 重组蛋白MBP-△4,5和MBP-△4,5~(△20)粗酶酶活测定 | 第71-72页 |
| 4.4.5 重组蛋白MBP-△4,5~(△20)的纯化 | 第72-74页 |
| 4.5 小结 | 第74页 |
| 参考文献 | 第74-75页 |
| 第五章 芳香磺基转移酶Ⅳ和△4,5不饱和葡萄糖醛酸酶应用 | 第75-87页 |
| 5.1 前言 | 第75-76页 |
| 5.2 实验材料 | 第76-78页 |
| 5.2.1 菌种 | 第76页 |
| 5.2.2 培养基、工具酶及试剂 | 第76-77页 |
| 5.2.3 实验仪器 | 第77-78页 |
| 5.3 实验方法 | 第78-80页 |
| 5.3.1 芳香磺基转移酶Ⅳ的应用 | 第78-79页 |
| 5.3.2 △4,5~(△20)不饱和葡萄糖醛酸酶的应用 | 第79-80页 |
| 5.4 结果与讨论 | 第80-86页 |
| 5.4.1 芳香磺基转移酶Ⅳ的应用 | 第80-81页 |
| 5.4.2 △4,5~(△20)不饱和葡萄糖醛酸酶的应用 | 第81-86页 |
| 5.5 小结 | 第86页 |
| 参考文献 | 第86-87页 |
| 第六章 结论与展望 | 第87-90页 |
| 6.1 结论 | 第87-88页 |
| 6.2 展望 | 第88-90页 |
| 致谢 | 第90-91页 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 | 第91页 |
