| 中文摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 前言 | 第8-13页 |
| 1. 肝豆状核变性是一类高度异质性的常染色体隐性遗传病 | 第8-9页 |
| 2. 目前肝豆状核变性治疗手段有限 | 第9-10页 |
| 3. R778L是亚洲地区肝豆状核变性最普遍的突变类型 | 第10页 |
| 4. 构建针对R778L类型突变的小鼠模型十分必要 | 第10-11页 |
| 5. CRISPR/Cas9介导的基因敲入为构建精准动物模型提供了可能 | 第11-13页 |
| 实验材料 | 第13-16页 |
| 1. 细胞 | 第13页 |
| 2. 菌株 | 第13页 |
| 3. 载体 | 第13页 |
| 4. 实验小鼠和饲料 | 第13页 |
| 5. 试剂和耗材 | 第13-14页 |
| 5.1 细胞试剂和耗材 | 第13-14页 |
| 5.2 生化试剂 | 第14页 |
| 6. 主要的仪器设备 | 第14页 |
| 7. 引物 | 第14-15页 |
| 8. 主要培养基的配制 | 第15页 |
| 9. 生物信息学分析软件及网站 | 第15-16页 |
| 实验方法 | 第16-34页 |
| 1. 载体构建相关实验 | 第16-17页 |
| 1.1 常规连接产物的转化 | 第16页 |
| 1.2 快速转化现有质粒 | 第16页 |
| 1.3 质粒小量提取 | 第16-17页 |
| 1.4 质粒大量提取 | 第17页 |
| 2. 细胞培养 | 第17-20页 |
| 2.1 原代MEF细胞的分离和培养 | 第17-19页 |
| 2.2 培养胚胎干细胞用滋养层细胞MEF的制备和培养 | 第19页 |
| 2.3 小鼠ES细胞培养 | 第19-20页 |
| 3. CRISPR/Cas9系统的设计 | 第20-22页 |
| 3.1 sgRNA的设计 | 第20页 |
| 3.2 同源重组模板单链寡聚核苷酸(ssODN)的设计 | 第20页 |
| 3.3 PX330载体的构建 | 第20-21页 |
| 3.4 小鼠ES细胞的电穿孔 | 第21-22页 |
| 3.5 T7E I酶切实验 | 第22页 |
| 4. 体外转录RNA | 第22-25页 |
| 4.1 体外转录模板DNA的准备 | 第22-23页 |
| 4.2 体外转录guide RNA | 第23页 |
| 4.3 体外转录获取Cas9 mRNA | 第23-25页 |
| 4.4 显微注射工作液的配置 | 第25页 |
| 5. 小鼠受精卵显微注射 | 第25-26页 |
| 6. 小鼠基因型鉴定 | 第26-27页 |
| 6.1 小鼠基因组的提取 | 第26页 |
| 6.2 PCR鉴定小鼠基因型 | 第26-27页 |
| 6.3 TA克隆 | 第27页 |
| 7. 血清生化指标检测 | 第27页 |
| 7.1 小鼠血清的提取 | 第27页 |
| 7.2 血清谷丙转氨酶/谷草转氨酶的检测 | 第27页 |
| 8. 小鼠肝脏相关指标检测 | 第27-29页 |
| 8.1 小鼠肝脏的收集 | 第27-28页 |
| 8.2 石蜡包埋切片 | 第28页 |
| 8.3 H&E染色 | 第28页 |
| 8.4 干的肝脏铜离子检测 | 第28-29页 |
| 9. 小鼠呼吸交换率的检测 | 第29页 |
| 9.1 代谢笼 | 第29页 |
| 9.2 呼吸交换率的检测 | 第29页 |
| 10. 脱靶效应的检测和评估 | 第29-34页 |
| 10.1 Deep sequence的建库 | 第30-33页 |
| 10.2 Deep sequence的分析 | 第33-34页 |
| 实验结果 | 第34-42页 |
| 1. ATP7B基因在人和小鼠中是高度保守的 | 第34-35页 |
| 2. 利用CRISPR/Cas9介导的基因敲入获得R780L突变小鼠 | 第35-37页 |
| 3. R780L纯合小鼠肝脏有明显的病理改变 | 第37-38页 |
| 4. R780L纯合小鼠肝脏有明显的铜离子淤积且肝脏损伤明显 | 第38-41页 |
| 5. R780L突变纯合模型鼠并未检测到脱靶情况 | 第41-42页 |
| 讨论 | 第42-44页 |
| 1. 本研究概述 | 第42页 |
| 2. R780L小鼠是研究R778L类型肝豆状核变性发病机制的理想模型 | 第42页 |
| 3. R780L小鼠是基因治疗R778L类型肝豆状核变性的合适载体 | 第42-43页 |
| 4. 本研究的不足:R778L类型肝豆状核变性的发病机制有待后续阐明 | 第43页 |
| 5. CRISPR/Cas9技术在疾病模型构建中的应用 | 第43页 |
| 6. 本研究的展望:R780L模型小鼠有望解释一部分肝豆状核变性基因型与表型不匹配这一领域难题 | 第43-44页 |
| 参考文献 | 第44-48页 |
| 文献综述 | 第48-63页 |
| 参考文献 | 第57-63页 |
| 英文名词及缩写 | 第63-64页 |
| 致谢 | 第64-65页 |
| 个人简历 | 第65-66页 |
