| 摘要 | 第8-10页 |
| Abstract | 第10-11页 |
| 1 综述 | 第12-19页 |
| 1.1 病原 | 第12-14页 |
| 1.1.1 CPV生物学特性 | 第12页 |
| 1.1.2 CPV基因组结构 | 第12-13页 |
| 1.1.3 主要蛋白VP2结构与功能 | 第13页 |
| 1.1.4 CPV的起源和进化 | 第13-14页 |
| 1.2 CPV致病机理与流行病学 | 第14-15页 |
| 1.2.1 CPV致病机理 | 第14-15页 |
| 1.2.2 CPV流行病学 | 第15页 |
| 1.3 CPV的诊断和预防 | 第15-17页 |
| 1.3.1 CPV的诊断 | 第15-16页 |
| 1.3.2 CPV的预防 | 第16-17页 |
| 1.4 杆状病毒表达系统作为表达工具的基因工程疫苗的发展 | 第17-19页 |
| 2 实验材料和方法 | 第19-45页 |
| 2.1 实验材料 | 第19-21页 |
| 2.1.1 菌株、质粒、病毒、细胞、小白鼠 | 第19页 |
| 2.1.2 相关试剂 | 第19-20页 |
| 2.1.3 实验仪器 | 第20-21页 |
| 2.2 实验室常用试剂配制 | 第21-24页 |
| 2.2.1 细菌培养基的配制 | 第21页 |
| 2.2.2 昆虫细胞Grace培养基的配制 | 第21页 |
| 2.2.3 抗生素配制与相关试剂 | 第21-22页 |
| 2.2.4 核酸电泳相关试剂配制方法 | 第22页 |
| 2.2.5 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂 | 第22-23页 |
| 2.2.6 蛋白免疫印迹所需试剂 | 第23页 |
| 2.2.7 蛋白纯化试剂 | 第23-24页 |
| 2.3 分子生物学基本操作 | 第24-29页 |
| 2.3.1 质粒的提取 | 第24-25页 |
| 2.3.2 琼脂糖凝胶电泳和回收 | 第25-26页 |
| 2.3.3 PCR溶液回收 | 第26页 |
| 2.3.4 感受态细胞制备方法 | 第26-28页 |
| 2.3.5 大肠杆菌Top10转化 | 第28-29页 |
| 2.3.6 菌种的保存 | 第29页 |
| 2.4 昆虫细胞培养基本操作 | 第29-31页 |
| 2.4.1 细胞复苏 | 第29页 |
| 2.4.2 细胞传代 | 第29-30页 |
| 2.4.3 细胞冻存 | 第30页 |
| 2.4.4 细胞计数 | 第30-31页 |
| 2.5 CPVVP2基因在杆状病毒表达系统中表达 | 第31-36页 |
| 2.5.1 杆状病毒表达载体的构建 | 第32-33页 |
| 2.5.2 转移载体的构建 | 第33-36页 |
| 2.6 重组杆状病毒的构建 | 第36-38页 |
| 2.6.1 Tn7转座 | 第36页 |
| 2.6.2 侵染蛋白介导的经济高效生产感染性重组病毒粒子 | 第36-37页 |
| 2.6.3 重组Bacmid菌液感染昆虫细胞 | 第37-38页 |
| 2.7 重组病毒鉴定和滴度的测定 | 第38-40页 |
| 2.7.1 提取病毒基因组 | 第38-39页 |
| 2.7.2 制作病毒q-PCR曲线测定滴度 | 第39页 |
| 2.7.3 终点稀释法测病毒滴度 | 第39-40页 |
| 2.8 蛋白表达检测 | 第40-42页 |
| 2.8.1 裂解细胞 | 第40页 |
| 2.8.2 样品处理 | 第40页 |
| 2.8.3 SDS-PAGE电泳 | 第40-41页 |
| 2.8.4 WesternBlot检测蛋白表达 | 第41-42页 |
| 2.9 表达蛋白的纯化和浓度测定 | 第42-43页 |
| 2.9.1 蛋白纯化 | 第42页 |
| 2.9.2 标签ELISA检测试剂盒测定蛋白浓度 | 第42-43页 |
| 2.10 动物实验 | 第43-45页 |
| 2.10.1 动物分组 | 第43页 |
| 2.10.2 抗原的制备 | 第43-44页 |
| 2.10.3 疫苗注射 | 第44页 |
| 2.10.4 免疫效果检测 | 第44-45页 |
| 3 结果与分析 | 第45-60页 |
| 3.1 CPVVP2基因的扩增和T载体克隆 | 第45-46页 |
| 3.1.1 19T-VP2菌液PCR鉴定 | 第45-46页 |
| 3.1.2 19T-VP2酶切鉴定 | 第46页 |
| 3.2 VP2基因测序 | 第46页 |
| 3.3 重组转移载体酶切鉴定 | 第46-48页 |
| 3.3.1 转移载体pYBDM-IM-p10VP | 第46-47页 |
| 3.3.2 转移载体pYBDM-IM-phVP | 第47-48页 |
| 3.3.3 转移载体pYBDM-IM-p10VP2-phPV | 第48页 |
| 3.4 重组Bacmid菌液PCR鉴定 | 第48-49页 |
| 3.5 重组杆状病毒基因组DNA的PCR验证 | 第49-50页 |
| 3.6 细胞荧光和病毒滴度 | 第50-54页 |
| 3.6.1 细胞荧光检测 | 第50-51页 |
| 3.6.2 终点稀释法测定重组病毒滴度 | 第51-53页 |
| 3.6.3 制作q-PCR标准曲线测定病毒滴度 | 第53-54页 |
| 3.7 CPVVP2蛋白检测 | 第54-57页 |
| 3.7.1 CPVVP2蛋白小量表达SDS-PAGE检测 | 第54-55页 |
| 3.7.2 CPVVP2蛋白WesternBlot检测 | 第55-56页 |
| 3.7.3 His标签ELISA检测试剂盒检测蛋白含量 | 第56-57页 |
| 3.8 CPVVP2蛋白纯化 | 第57-59页 |
| 3.8.1 CPVVP2蛋白纯化结果 | 第57-58页 |
| 3.8.2 纯化蛋白的WesternBlot鉴定 | 第58-59页 |
| 3.9 CPVVP2蛋白免疫原性检测结果 | 第59-60页 |
| 4 讨论 | 第60-62页 |
| 参考文献 | 第62-66页 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 | 第66-67页 |
| 致谢 | 第67页 |
