| Acknowledgements | 第4-12页 |
| List of abbreviations | 第12-14页 |
| Summary | 第14-16页 |
| Chapter 1 A review of advanced research on infectious bronchitis virus and vaccinedevelopment | 第17-37页 |
| 1. Coronavirus avian infectious bronchitis virus | 第17-27页 |
| 1.1 Classification | 第17-19页 |
| 1.2 Structure and morphology | 第19-20页 |
| 1.3 Genome organization | 第20-21页 |
| 1.4 Nonstructural proteins | 第21页 |
| 1.5 Structural proteins | 第21-23页 |
| 1.5.1 Spike protein | 第21-22页 |
| 1.5.2 Envelope protein | 第22页 |
| 1.5.3 Membrane protein | 第22页 |
| 1.5.4 Nucleocapsid protein | 第22-23页 |
| 1.5.5 Accessory proteins | 第23页 |
| 1.6 Replication cycle | 第23-25页 |
| 1.6.1 Attachment and entry | 第23-24页 |
| 1.6.2 Replication and transcription | 第24-25页 |
| 1.6.3 Translation | 第25页 |
| 1.6.4 Assembly and budding | 第25页 |
| 1.7 Pathogenesis of IBV | 第25-27页 |
| 2. Vaccine development against IBV | 第27-30页 |
| 2.1 Live vaccines | 第28页 |
| 2.2 Inactivated virus and subunit vaccines | 第28-29页 |
| 2.3 Vector vaccines | 第29页 |
| 2.4 Recombinant Human adenovirus serotype 5 as vaccine candidate | 第29-30页 |
| 3. Aims of the study | 第30-31页 |
| References | 第31-37页 |
| Chapter 2 Identification of a nephropathogenic strain of infectious bronchitis virus(IBV) | 第37-55页 |
| Abstract | 第37-38页 |
| 1. Introduction | 第38-39页 |
| 2. Materials and methods | 第39-48页 |
| 2.1 Embryonated eggs and chickens | 第39页 |
| 2.2 Virus isolation and propagation | 第39-44页 |
| 2.2.1 Incubation of eggs before inoculation | 第39-40页 |
| 2.2.2 Incubation of eggs after inoculation | 第40页 |
| 2.2.3 Candling eggs to determining the viability of the embryo | 第40-41页 |
| 2.2.4 Marking the inoculation site | 第41-42页 |
| 2.2.5 Inoculation of embryonated eggs by the allantoic cavity route | 第42页 |
| 2.2.6 Protocol of virus inoculation | 第42-44页 |
| 2.3 Virus titration | 第44-45页 |
| 2.3.1 Collection of blood from chickens | 第44页 |
| 2.3.2 Washing the red blood cells | 第44-45页 |
| 2.3.3 Hemagglutination(HA)assay | 第45页 |
| 2.4 Determination of 50 percent embryo infectious dose(EID_(50)) | 第45-46页 |
| 2.5 Experimental infection of chicken | 第46页 |
| 2.6 Histopatological analysis | 第46-47页 |
| 2.7 Virus recovery by RT-PCR | 第47-48页 |
| 3. Results and discussion | 第48-52页 |
| 3.1 Determination of chicken embryos inoculated with EID_(50) | 第48-49页 |
| 3.2 Clinical signs and gross lesions | 第49-50页 |
| 3.3 Histopathological changes | 第50-51页 |
| 3.4 PCR identification of IBV | 第51-52页 |
| References | 第52-55页 |
| CHAPTER 3 Cloning, prokaryotic expression and identification of truncated Spikegene of IBV (Scoo) and chicken granulocyte- macrophage colonystimulating factor (GM-CSF) | 第55-81页 |
| Abstract | 第55-56页 |
| 1. Introduction | 第56-57页 |
| 2. Materials and methods | 第57-73页 |
| 2.1 Strategies for protein expression in E. coli | 第57页 |
| 2.2 Virus and mice | 第57-58页 |
| 2.3 RNA extraction and reverse transcription | 第58-59页 |
| 2.4 Amplification of truncated fragments of S1(S_(f200))and GM-CSF | 第59-61页 |
| 2.4.1 Agarose gel electrophoresis | 第61页 |
| 2.5 Construction of prokaryotic expression vectors | 第61-65页 |
| 2.5.1 Protocol of DNA purification using gel extraction kit | 第61-63页 |
| 2.5.2 Restriction digestion protocol | 第63-64页 |
| 2.5.3 Quantification of DNA and RNA using spectrophotometer | 第64页 |
| 2.5.4 Ligation protocol | 第64-65页 |
| 2.6 Transformation protocol | 第65-66页 |
| 2.6.1 Preparation of competent E.coli using CaCl_2 | 第65页 |
| 2.6.2 Transformation of plasmid to competent cells | 第65-66页 |
| 2.7 Plasmid extraction(Mini prep method) | 第66-68页 |
| 2.8 Expression and purification of recombinant S_(f200) and GM-CSF proteins | 第68页 |
| 2.9 Generation of polyclonal antisera in mice | 第68-69页 |
| 2.10 SDS-PAGE and Western blot | 第69-73页 |
| 2.10.1 SDS-PAGE Protocol | 第69-70页 |
| 2.10.2 Western blotting protocol | 第70-73页 |
| 3. Results and discussion | 第73-77页 |
| 3.1 Antigencity Index of S_(f200) anf GM-CSF | 第73-74页 |
| 3.2 Cloning and sequence analysis of S_(f200) and GM-CSF genes | 第74-75页 |
| 3.3 Identification of recombinant pET-32a-S_(f200) and pET-32a-GM | 第75页 |
| 3.4 SDS-PAGE and immunobloting | 第75-77页 |
| References | 第77-81页 |
| Chapter 4 Immunogenicity and protective efficacy of a replication-defective infectiousbronchitis virus vaccine using an adenovirus vector and administeredin ovo | 第81-109页 |
| Abstract | 第81-82页 |
| 1. Introduction | 第82-85页 |
| 1.1 A replication-deficient recombinant adenovirus | 第82-84页 |
| 1.2 In ovo immunization | 第84-85页 |
| 2. Materials and methods | 第85-96页 |
| 2.1 Embryonated eggs and chickens | 第85页 |
| 2.2 Viruses and cells | 第85-86页 |
| 2.3 Cloning and sequencing of S1 | 第86-87页 |
| 2.4 Cloning S1 of IBV into a pAdTrack-CMV shuttle vector | 第87页 |
| 2.5 Generating recombinant adenovirus plasmids using AdEasier cells | 第87-91页 |
| 2.5.1 Protocol for making electrocompetent bacteria cells | 第89页 |
| 2.5.2 Checking competency of electrocompetent cells | 第89-90页 |
| 2.5.3 Transformation by electroporation | 第90-91页 |
| 2.6 Generating recombinant adenoviruses in HEK-293 packaging cells | 第91-92页 |
| 2.7 Preparation of recombinant adenovirus stolcks | 第92页 |
| 2.8 Identification and Expression ofIBV S1 glycoprotein by recombinant virus | 第92-93页 |
| 2.8.1 Immunofluorescence assay | 第92页 |
| 2.8.2 Western blot analysis | 第92-93页 |
| 2.9 Immunization of chickens with the recombinant Ad5 vector vaccine | 第93页 |
| 2.10 Detection of anti-IBV specific antibodies | 第93-94页 |
| 2.11 Cytokine assays | 第94-95页 |
| 2.12 Protective efficacy against virulent IBV challenge | 第95页 |
| 2.13 Detecting of IBV in kidney tissues by RT-PCR | 第95页 |
| 2.14 Pathological examination | 第95页 |
| 2.15 Statistics | 第95-96页 |
| 3. Results | 第96-103页 |
| 3.1 Amplification and cloning of S1 gene of IBV | 第96页 |
| 3.2 Identification of recombinant plasmid(rAdTrack-S1) | 第96-97页 |
| 3.3 Identification of recombinant adenovirus plasmid(rAdEasy-S1) | 第97页 |
| 3.4 Harvesting of recombinant adenovirus | 第97-98页 |
| 3.5 Detection of S1 mRNA by RT-PCR | 第98页 |
| 3.6 Expression of IBV S 1 glycoprotein by recombinant adenovirus | 第98-99页 |
| 3.7 Humoral immune responses of recombinant adenovirus vectored IBV vaccine | 第99-100页 |
| 3.8 Th1-type and Th2-type cytokine responses in vaccinated chickens | 第100-101页 |
| 3.9 Protective efficacy against virulent IBV challenge | 第101-103页 |
| 4. Discussion | 第103-105页 |
| Acknowledgements | 第105页 |
| References | 第105-109页 |
| CHAPTER 5 Protective immune responses induced by in ovo immunization withrecombinant adenoviruses expressing Spike (SI) glycoprotein ofinfectious bronchitis virus fused/co-administered with granulocyte-macrophage colony stimulating factor | 第109-133页 |
| Abstract | 第109-110页 |
| 1. Introduction | 第110-112页 |
| 1.1 Cytokines as adjuvants | 第110-111页 |
| 1.2 Chicken cytokines as potential adjuvants | 第111-112页 |
| 2. Materials and methods | 第112-118页 |
| 2.1 Embryonated eggs and chickens | 第112页 |
| 2.2 Viruses and cells | 第112-113页 |
| 2.3 Amplification of mature peptide of chicken GM-CSF gene | 第113页 |
| 2.4 Construction and generation of recombinant adenoviruses | 第113-114页 |
| 2.5 Identification of recombinant viruses | 第114-115页 |
| 2.5.1 Western blot assay | 第114-115页 |
| 2.5.2 Immunofluorescence assay(IFA) | 第115页 |
| 2.6 Bone marrow proliferation assay | 第115-116页 |
| 2.7 Animal experiments | 第116-118页 |
| 2.7.1 Vaccination of chickens with recombinant adenoviruses | 第116页 |
| 2.7.2 Detection of anti-IBV specific antibodies | 第116页 |
| 2.7.3 T lymphocyte proliferation assay | 第116-117页 |
| 2.7.4 Cytokine assays | 第117页 |
| 2.7.5 Protection against virulent challenge | 第117页 |
| 2.7.6 Detecting of virus in kidney tissues by RT-PCR | 第117页 |
| 2.7.7 Pathological examination | 第117-118页 |
| 2.8 Statistics | 第118页 |
| 3. Results | 第118-125页 |
| 3.1 Construction and characterization of recombinant viruses | 第118页 |
| 3.2 Expression of recombinant proteins | 第118-119页 |
| 3.3 Bioactivity of GM-CSF | 第119-120页 |
| 3.4 Induction of immune responses | 第120-122页 |
| 3.4.1 Humoral immune responses | 第120-121页 |
| 3.4.2 Th1-type and Th2-type cytokine responses | 第121-122页 |
| 3.5 S1-protein-specific T cell proliferation | 第122-123页 |
| 3.6 Protection of chickens against IBV challenge | 第123-125页 |
| 4. Discussion | 第125-127页 |
| Acknowledgements | 第127页 |
| References | 第127-133页 |
| Conclusion and perspective | 第133-134页 |
| Research publications | 第134-135页 |
| Abstract and presentations | 第135页 |
