| 摘要 | 第8-10页 |
| Abstract | 第10-12页 |
| 缩略词表 | 第13-14页 |
| 第一部分 文献综述 | 第14-25页 |
| 第一章 肌肉生长抑制素的研究进展 | 第14-20页 |
| 1. 肌肉生长抑制素的基本特性 | 第14-17页 |
| 1.1 肌肉生长抑制素的结构和组织分布 | 第14-16页 |
| 1.2 肌肉生长抑制素的生物学功能 | 第16-17页 |
| 2 肌肉生长抑制素的应用前景 | 第17-20页 |
| 2.1 肌肉生长抑制素在动物生产中的应用 | 第17-18页 |
| 2.2 肌肉生长抑制素在医学研究中的应用 | 第18-20页 |
| 第二章 肌肉生长抑制素RNAi及转基因牛的研究进展 | 第20-25页 |
| 1 RNAi的作用机制 | 第20-21页 |
| 2 RNAi在基因功能研究中的应用 | 第21页 |
| 3 慢病毒介导的转基因牛的初步研究 | 第21-23页 |
| 3.1 转基因牛的研究进展 | 第21-22页 |
| 3.2 应用慢病毒介导的RNAi技术制备转基因牛 | 第22-23页 |
| 4 研究目的与意义 | 第23-25页 |
| 第二部分 试验研究 | 第25-59页 |
| 第三章 MSTN基因RNAi瞬时表达载体的构建 | 第25-42页 |
| 1 前言 | 第25页 |
| 2 试验材料 | 第25-29页 |
| 2.1 干扰载体 | 第25-26页 |
| 2.2 试验细胞 | 第26页 |
| 2.3 主要酶及试剂 | 第26页 |
| 2.4 细胞培养液及其他溶液的配制 | 第26-28页 |
| 2.5 主要的仪器设备 | 第28-29页 |
| 3 试验方法 | 第29-37页 |
| 3.1 细胞培养 | 第29页 |
| 3.1.1 细胞传代 | 第29页 |
| 3.1.2 细胞的复苏与冻存 | 第29页 |
| 3.2 MSTN基因RNAi干扰载体的构建 | 第29-34页 |
| 3.2.1 设计与合成shRNA序列 | 第29-31页 |
| 3.2.2 退火 | 第31页 |
| 3.2.3 重组质粒的构建 | 第31-32页 |
| 3.2.4 重组质粒鉴定 | 第32-33页 |
| 3.2.5 RNA干扰质粒克隆与纯化提取 | 第33-34页 |
| 3.3 RNA干扰质粒转染牛胎儿成纤维细胞 | 第34页 |
| 3.4 细胞总RNA的提取和反转录cDNA | 第34-36页 |
| 3.4.1 提取细胞总RNA | 第34-35页 |
| 3.4.2 RNA质量检测 | 第35页 |
| 3.4.3 反转录 | 第35-36页 |
| 3.4.4 纯化cDNA | 第36页 |
| 3.5 Real time PCR反应 | 第36-37页 |
| 3.5.1 PCR引物设计和合成 | 第36页 |
| 3.5.2 荧光定量PCR | 第36-37页 |
| 3.6 结果统计分析 | 第37页 |
| 4. 实验结果 | 第37-41页 |
| 4.1 MSTN基因RNA干扰重组质粒 | 第37-39页 |
| 4.1.1 酶切电泳检测 | 第37-38页 |
| 4.1.2 测序结果 | 第38-39页 |
| 4.2 重组质粒转染牛胎儿成纤维细胞 | 第39页 |
| 4.3 提取细胞总RNA的检测结果 | 第39-40页 |
| 4.4 Real time PCR的结果 | 第40-41页 |
| 5. 讨论 | 第41-42页 |
| 第四章 MSTN基因RNAi慢病毒载体的构建及其转基因细胞株的筛选 | 第42-59页 |
| 1 前言 | 第42页 |
| 2. 试验材料 | 第42-46页 |
| 2.1 质粒 | 第42-43页 |
| 2.2 试验细胞 | 第43页 |
| 2.3 主要酶及试剂 | 第43-44页 |
| 2.4 细胞培养液及其他溶液的配制 | 第44-45页 |
| 2.5 主要仪器设备 | 第45-46页 |
| 3. 试验方法 | 第46-52页 |
| 3.1 pENT/U6重组质粒的构建 | 第46-48页 |
| 3.1.1 退火 | 第46-47页 |
| 3.1.2 连接反应 | 第47页 |
| 3.1.3 转化反应 | 第47-48页 |
| 3.2 pU6/RNAi表达载体的构建 | 第48-49页 |
| 3.2.1 LR重组反应 | 第48页 |
| 3.2.2 转化反应 | 第48-49页 |
| 3.3 慢病毒载体构建及滴度测定 | 第49-51页 |
| 3.3.1 293FT包装细胞的复苏 | 第49页 |
| 3.3.2 慢病毒载体的包装 | 第49-50页 |
| 3.3.3 稻瘟菌素敏感性实验 | 第50页 |
| 3.3.4 慢病毒滴度测定 | 第50-51页 |
| 3.3.5 稳定转染牛胎儿成纤维细胞的筛选及鉴定 | 第51页 |
| 3.4 荧光定量PCR | 第51-52页 |
| 3.4.1 细胞总RNA提取 | 第51-52页 |
| 3.4.2 逆转录生成cDNA | 第52页 |
| 3.4.3 Real-time PCR | 第52页 |
| 3.5 结果统计分析 | 第52页 |
| 4 试验结果与分析 | 第52-57页 |
| 4.1 pENT/U6载体的鉴定 | 第52-53页 |
| 4.2 pU6/RNAi表达载体凝胶电泳鉴定 | 第53-54页 |
| 4.3 慢病毒滴度测定 | 第54-55页 |
| 4.4 稳定转染牛胎儿成纤维细胞的筛选及鉴定 | 第55-56页 |
| 4.5 荧光定量PCR结果 | 第56-57页 |
| 5 讨论 | 第57-59页 |
| 第五章 全文小结 | 第59-60页 |
| 参考文献 | 第60-67页 |
| 致谢 | 第67页 |