| 摘要 | 第9-12页 |
| Abstract | 第12-14页 |
| 第一章 绪论 | 第16-50页 |
| 1. 环磷酸腺苷受体蛋白及其研究概况 | 第16-26页 |
| 1.1 CRP蛋白的概述 | 第16-17页 |
| 1.2 CRP的结构 | 第17-18页 |
| 1.5 CRP与启动子DNA的相互作用 | 第18-19页 |
| 1.6 CRP与RNA聚合酶(RNAP)的相互作用 | 第19-21页 |
| 1.7 cAMP诱导的CRP的二级结构变化 | 第21-22页 |
| 1.8 cAMP诱导的CRP构象变化 | 第22-23页 |
| 1.9 cAMP结合口袋 | 第23-24页 |
| 1.10 CRP中的loop 3和loop 4的结构和功能 | 第24-25页 |
| 1.11 CRP中铰链区的结构和功能 | 第25-26页 |
| 2. 丙酮酸激酶及其研究概况 | 第26-35页 |
| 2.1 糖酵解途径简介 | 第26-27页 |
| 2.2 丙酮酸激酶的概述 | 第27-28页 |
| 2.3 丙酮酸激酶的结构 | 第28-31页 |
| 2.3.1 PK的活性部位 | 第30页 |
| 2.3.2 活化离子的结合位点 | 第30-31页 |
| 2.3.3 底物的结合位点 | 第31页 |
| 2.3.4 抑制剂的结合位点 | 第31页 |
| 2.4 配体诱导下的丙酮酸激酶结构和构象变化 | 第31-35页 |
| 2.4.1 活化离子诱导下的丙酮酸激酶结构和构象变化 | 第31-33页 |
| 2.4.2 底物诱导下的丙酮酸激酶结构和构象变化 | 第33页 |
| 2.4.3 抑制剂诱导下的丙酮酸激酶结构和构象变化 | 第33-34页 |
| 2.4.4 变性剂诱导下的丙酮酸激酶结构和构象变化 | 第34-35页 |
| 2.5. 丙酮酸激酶变构调控的热动力学研究 | 第35页 |
| 3. 本研究的目的和意义 | 第35-36页 |
| 参考文献 | 第36-50页 |
| 第二章 CRP蛋白cAMP结合结构域的结晶和晶体结构解析 | 第50-76页 |
| 1. 研究背景 | 第50-51页 |
| 2. 实验部分 | 第51-57页 |
| 2.1 实验设计 | 第51页 |
| 2.2 实验材料 | 第51-52页 |
| 2.2.1 质粒和菌种 | 第51页 |
| 2.2.2 实验试剂 | 第51页 |
| 2.2.3 实验仪器 | 第51-52页 |
| 2.3 实验方法 | 第52-57页 |
| 2.3.1 大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl_2法) | 第52页 |
| 2.3.2 WT-CRP的质粒转化 | 第52-53页 |
| 2.3.3 WT-CRP的预表达 | 第53页 |
| 2.3.4 WT-CRP的大量表达 | 第53页 |
| 2.3.5 WT-CRP的纯化 | 第53-55页 |
| 2.3.5.1 Bio-Rex70层析 | 第53-54页 |
| 2.3.5.2 hydroxyapatite离子交换 | 第54页 |
| 2.3.5.3 Phenyl Sepharose层析 | 第54-55页 |
| 2.3.6 WT-CRP的酶切 | 第55页 |
| 2.3.7 α-CRP(S-CRP和CH-CRP)的纯化 | 第55页 |
| 2.3.7.1 Bio-Rex70层析 | 第55页 |
| 2.3.8 α-CRP(S-CRP和CH-CRP)的结晶 | 第55-57页 |
| 2.3.8.1 α-CRP(S-CRP和CH-CRP)的浓缩 | 第55-56页 |
| 2.3.8.2 α-CRP(S-CRP和CH-CRP)晶体生长条件的筛选 | 第56页 |
| 2.3.8.3 α-CRP(S-CRP和CH-CRP)晶体生长条件的优化 | 第56-57页 |
| 2.3.8.4 α-CRP(S-CRP和CH-CRP)晶体衍射数据的收集 | 第57页 |
| 2.3.8.5 α-CRP晶体结构解析 | 第57页 |
| 3. 实验结果与讨论 | 第57-74页 |
| 3.1 WT-CRP的预表达 | 第57-58页 |
| 3.2 WT-CRP的纯化 | 第58-59页 |
| 3.3 α-CRP(S-CRP和CH-CRP)的纯化 | 第59-60页 |
| 3.4 α-CRP(S-CRP和CH-CRP)的结晶 | 第60-64页 |
| 3.4.1 α-CRP(S-CRP和CH-CRP)的浓缩 | 第60-61页 |
| 3.4.2 α-CRP(S-CRP和CH-CRP)的晶体 | 第61-62页 |
| 3.4.3 α-CRP碎片蛋白(S-CRP和CH-CRP)晶体的衍射数据 | 第62-64页 |
| 3.4.3.1 α-CRP的晶体衍射图 | 第62-63页 |
| 3.4.3.2 α-CRP的晶体衍射数据 | 第63-64页 |
| 3.5 S-CRP-cAMP复合体的晶体结构解析 | 第64-73页 |
| 3.5.1 第一种类型的S-CRP-cAMP复合体 | 第64-65页 |
| 3.5.2 第二种类型的S-CRP-cAMP复合体 | 第65-68页 |
| 3.5.3 第三种类型的S-CRP-cAMP复合体 | 第68-70页 |
| 3.5.4 三种类型的S-CRP-cAMP复合体之间的关系 | 第70-73页 |
| 3.6 CH-CRP的晶体结构 | 第73-74页 |
| 4. 本章小结 | 第74页 |
| 参考文献 | 第74-76页 |
| 第三章 CRP蛋白cAMP结合结构域的动态性研究 | 第76-92页 |
| 1. 研究背景 | 第76页 |
| 2. 实验部分 | 第76-78页 |
| 2.1 实验设计 | 第76页 |
| 2.2 实验材料 | 第76-77页 |
| 2.2.1 实验试剂 | 第76-77页 |
| 2.2.2 实验仪器 | 第77页 |
| 2.3 实验方法 | 第77-78页 |
| 2.3.1 α-CRP(S-CRP和CH-CRP)的傅里叶变换红外光谱 | 第77页 |
| 2.3.2 α-CRP的H-D交换反应 | 第77-78页 |
| 3. 实验结果与讨论 | 第78-90页 |
| 3.1 α-CRP(S-CRP和CH-CRP)结合cAMP前后二级结构的比较 | 第78-84页 |
| 3.1.1 FT-IR吸收谱和二阶导数谱的比较 | 第78-81页 |
| 3.1.2 二级结构组成的比较 | 第81-84页 |
| 3.2 α-CRP(S-CRP和CH-CRP)结合cAMP前后H-D交换率的比较 | 第84-90页 |
| 3.2.1 H-D交换的FT-IR吸收谱和二阶导数谱的比较 | 第84-89页 |
| 3.2.2 质子交换率的比较 | 第89-90页 |
| 4. 本章小结 | 第90页 |
| 参考文献 | 第90-92页 |
| 第四章 丙酮酸激酶在配体诱导下的变构机理研究 | 第92-122页 |
| 1. 研究背景 | 第92-93页 |
| 2. 实验部分 | 第93-103页 |
| 2.1 实验设计 | 第93-94页 |
| 2.2 实验材料 | 第94-95页 |
| 2.2.1 质粒和菌种 | 第94页 |
| 2.2.2 实验试剂 | 第94页 |
| 2.2.3 实验仪器 | 第94-95页 |
| 2.3 实验方法 | 第95-103页 |
| 2.3.1 大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞的制备(CaCl_2法) | 第95页 |
| 2.3.2 WT-PK的质粒转化 | 第95页 |
| 2.3.3 WT-PK的菌种保存 | 第95-96页 |
| 2.3.4 WT-PK的质粒扩增与鉴定 | 第96-97页 |
| 2.3.4.1 WT-PK的质粒DNA的抽提 | 第96-97页 |
| 2.3.5 W481A/W514A-PK和W157A-PK的定点突变与鉴定 | 第97-98页 |
| 2.3.5.1 诱导突变基因(PCR反应) | 第97-98页 |
| 2.3.5.2 突变质粒的选择 | 第98页 |
| 2.3.5.3 突变质粒的转化 | 第98页 |
| 2.3.5.4 序列分析 | 第98页 |
| 2.3.6 WT-PK、W481A/W514A-PK和W157A-PK的预表达 | 第98页 |
| 2.3.7 WT-PK、W481A/W514A-PK和W157A-PK的大量表达 | 第98-99页 |
| 2.3.8 WT-PK、W481A/W514A-PK和W157A-PK的纯化 | 第99-100页 |
| 2.3.9 丙酮酸激酶的浓度测定 | 第100页 |
| 2.3.10 丙酮酸激酶的活性测定 | 第100页 |
| 2.3.11 丙酮酸激酶的圆二色谱测定 | 第100-101页 |
| 2.3.12 丙酮酸激酶的傅里叶变换红外光谱测定 | 第101页 |
| 2.3.13 丙酮酸激酶的丙烯酰胺荧光淬灭 | 第101-102页 |
| 2.3.14 不同浓度的盐酸胍(GdnHCl)对丙酮酸激酶的圆二色值的影响 | 第102页 |
| 2.3.15 不同浓度的盐酸胍(GdnHCl)对丙酮酸激酶的荧光强度影响 | 第102页 |
| 2.3.16 不同浓度的盐酸胍(GdnHCl)对丙酮酸激酶荧光淬的影响 | 第102-103页 |
| 3. 实验结果与讨论 | 第103-119页 |
| 3.1 WT-PK、W481A/W514A-PK和W157A-PK的预表达 | 第103页 |
| 3.2 WT-PK、W481A/W514A-PK和W157A-PK的纯化 | 第103-104页 |
| 3.3 WT-PK、W481A/W514A-PK和W157A-PK的浓度 | 第104页 |
| 3.4 WT-PK、W481A/W514A-PK和W157A-PK的活性 | 第104-105页 |
| 3.5 WT-PK、W481A/W514A-PK和W157A-PK的圆二色谱测定 | 第105页 |
| 3.6 WT-PK、W481A/W514A-PK和W157A-PK的二级结构 | 第105-108页 |
| 3.7 WT-PK、W481A/W514A-PK和W157A-PK的荧光淬灭 | 第108-119页 |
| 3.7.1 活化离子对丙酮酸激酶的丙烯酰胺荧光淬灭影响 | 第108-109页 |
| 3.7.2 底物对丙酮酸激酶的丙烯酰胺荧光淬灭影响 | 第109页 |
| 3.7.3 抑制剂和变性剂对丙酮酸激酶的丙烯酰胺荧光淬灭影响 | 第109-113页 |
| 3.7.4 盐酸胍对丙酮酸激酶的影响 | 第113-119页 |
| 3.7.4.1 不同浓度盐酸胍对丙酮酸激酶的圆二色值的影响 | 第113-114页 |
| 3.7.4.2 不同浓度盐酸胍对丙酮酸激酶的荧光强度的影响 | 第114页 |
| 3.7.4.3 不同浓度的盐酸胍对丙酮酸激酶的荧光淬灭的影响 | 第114-117页 |
| 3.7.4.4 活化离子和底物对盐酸胍诱导丙酮酸激酶荧光淬灭的影响 | 第117-119页 |
| 4. 本章小结 | 第119页 |
| 参考文献 | 第119-122页 |
| 第五章 丙酮酸激酶催化变构机理的热动力学研究 | 第122-148页 |
| 1. 研究背景 | 第122-123页 |
| 2. 实验部分 | 第123-130页 |
| 2.1 实验设计 | 第123页 |
| 2.2 实验材料 | 第123-124页 |
| 2.2.1 质粒和菌种 | 第123页 |
| 2.2.2 实验试剂 | 第123页 |
| 2.2.3 实验仪器 | 第123-124页 |
| 2.3 实验方法 | 第124-130页 |
| 2.3.1 WT-PK蛋白样品的制备 | 第124页 |
| 2.3.2 丙酮酸激酶的活性测定 | 第124-125页 |
| 2.3.2.1 不同钾离子浓度条件下酶活性的测定 | 第124页 |
| 2.3.2.2 不同镁离子浓度条件下酶活性的测定 | 第124-125页 |
| 2.3.2.3 不同抑制剂(苯丙氨酸)浓度条件下酶活性的测定 | 第125页 |
| 2.3.3 PK催化反应的等温滴定量热实验 | 第125-127页 |
| 2.3.3.1 等温滴定微量量热技术 | 第125-127页 |
| 2.3.4 酶浓度的影响 | 第127-128页 |
| 2.3.4.1 实验条件 | 第128页 |
| 2.3.5 活化离子和抑制剂浓度的影响 | 第128-130页 |
| 2.3.5.1 实验条件一 | 第129页 |
| 2.3.5.2 实验条件二 | 第129-130页 |
| 2.3.5.3 实验条件三 | 第130页 |
| 3. 实验结果与讨论 | 第130-145页 |
| 3.1 丙酮酸激酶活性的测定 | 第130-133页 |
| 3.1.1 不同钾离子浓度条件下酶活性的测定 | 第130页 |
| 3.1.2 不同镁离子浓度条件下酶活性的测定 | 第130-131页 |
| 3.1.3 不同苯丙氨酸浓度条件下酶活性的测定 | 第131-133页 |
| 3.2 丙酮酸激酶催化反应的等温滴定量热分析 | 第133-143页 |
| 3.2.1 酶浓度的影响 | 第133-135页 |
| 3.2.2 钾离子浓度的影响 | 第135-138页 |
| 3.2.3 镁离子浓度的影响 | 第138-140页 |
| 3.2.4 Phe浓度的影响 | 第140-143页 |
| 3.3 活化离子和抑制剂浓度对热力学焓变的影响 | 第143-145页 |
| 4. 本章小结 | 第145页 |
| 参考文献 | 第145-148页 |
| 论文发表情况 | 第148-149页 |
| 致谢 | 第149-150页 |
