| 摘要 | 第1-9页 |
| Abstract | 第9-12页 |
| 前言 | 第12-22页 |
| 1. 全球人口老龄化问题日益严重 | 第12页 |
| 2. 衰老学说 | 第12-14页 |
| 3. 内皮细胞衰老在血管老化及内皮功能失常中发挥重要作用 | 第14-16页 |
| ·细胞衰老的分子机制 | 第14-15页 |
| ·内皮细胞衰老在内皮功能失常及年龄相关的心血管疾病中的作用 | 第15-16页 |
| 4. SIRT1在衰老中的作用 | 第16-18页 |
| ·SIRT1与能量限制引起的长寿之间的关系 | 第16-17页 |
| ·SIRT1在内皮细胞衰老中的作用 | 第17-18页 |
| 5. PAI-1在衰老中的作用 | 第18-21页 |
| 6. SIRT1能否在体内抑制内皮细胞衰老和年龄依赖的血管老化及其分子机制探讨是本研究的重点 | 第21-22页 |
| 实验材料 | 第22-24页 |
| 1. 菌株与质粒 | 第22页 |
| 2. 细胞系 | 第22页 |
| 3. 实验用小鼠及饲料 | 第22页 |
| 4. 限制性内切酶和其他修饰酶 | 第22页 |
| 5. 其他主要试剂 | 第22-23页 |
| 6. 实验用抗体 | 第23页 |
| 7. 主要仪器设备 | 第23-24页 |
| 实验方法 | 第24-43页 |
| 1. 细菌操作与质粒的转化 | 第24-25页 |
| ·感受态大肠杆菌DHS-α制备 | 第24页 |
| ·质粒的转化和扩增 | 第24页 |
| ·质粒的提取和纯化 | 第24-25页 |
| 2. 细胞培养 | 第25-26页 |
| ·细胞的生长条件 | 第25页 |
| ·细胞的传代 | 第25页 |
| ·细胞的复苏及冻存 | 第25-26页 |
| 3. 人脐静脉内皮细胞(HUVEC)分离培养与腺病毒感染 | 第26-27页 |
| ·HUVEC的分离培养 | 第26-27页 |
| ·HUVEC的腺病毒感染 | 第27页 |
| 4. 重组腺病毒的制备 | 第27-29页 |
| ·建立备用病毒 | 第27-28页 |
| ·重组腺病毒的生产 | 第28页 |
| ·病毒纯化 | 第28-29页 |
| ·重组腺病毒质量检测 | 第29页 |
| 5. 双荧光素酶报告系统测定启动子活性 | 第29-30页 |
| 6. 定量RT-PCR(realtime RT-PCR) | 第30-31页 |
| ·RNA提取 | 第30页 |
| ·逆转录PCR(RT-PCR) | 第30-31页 |
| 7. Western blotting | 第31-33页 |
| ·细胞及组织总蛋白提取 | 第31页 |
| ·蛋白质浓度测定 | 第31-32页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第32-33页 |
| ·抗原抗体反应 | 第33页 |
| ·辣根过氧化物酶化学发光法检测蛋白(ECL反应) | 第33页 |
| ·溶液配制 | 第33页 |
| 8. 染色质免疫共沉淀(ChIP) | 第33-37页 |
| ·溶液配制 | 第33-34页 |
| ·ChIP实验步骤 | 第34-37页 |
| 9. HUVEC衰老染色 | 第37页 |
| ·senescence detection kit components | 第37页 |
| ·实验步骤 | 第37页 |
| 10. PCR鉴定转基因鼠 | 第37-38页 |
| 11. 小鼠组织器官的采集和保存 | 第38页 |
| 12. 组织蛋白提取 | 第38-39页 |
| ·蛋白提取缓冲液RIPA的成分 | 第38页 |
| ·用RIPA缓冲液提取组织蛋白 | 第38-39页 |
| 13. 血管环张力实验 | 第39-40页 |
| 14. 免疫组化(二步法) | 第40-41页 |
| ·脱蜡 | 第40页 |
| ·消除内源性过氧化物酶 | 第40页 |
| ·高压法热抗原修复 | 第40-41页 |
| ·抗体杂交 | 第41页 |
| ·DAB显色,复染 | 第41页 |
| ·封片 | 第41页 |
| 15. PWV检测 | 第41页 |
| 16. 小鼠血浆PAI-1活性检测 | 第41-42页 |
| 17. 统计学方法 | 第42-43页 |
| 实验结果 | 第43-64页 |
| 1. 内皮细胞复制型衰老模型的构建 | 第43-44页 |
| 2. SIRT1、PAI-1及其他衰老相关标记分子在衰老内皮细胞中的表达情况 | 第44-46页 |
| 3. SIRT1、PAI-1及其他衰老相关标记分子在老龄C57小鼠主动脉中表达情况 | 第46-48页 |
| 4. SIRT1抑制HUVECs的复制型衰老 | 第48-49页 |
| 5. 内皮细胞特异性SIRT1过表达延缓年龄依赖的的血管老化 | 第49-52页 |
| 6. 内皮细胞特异性SIRT1过表达改善内皮细胞依赖的血管舒张功能 | 第52-53页 |
| 7. 内皮细胞特异性SIRT1过表达改善小鼠主动脉硬化程度 | 第53-54页 |
| 8. SIRT1调控PAI-1表达及其机制探讨 | 第54-64页 |
| ·SIRT1在转录水平抑制PAI-1表达 | 第54-58页 |
| ·内源性SIRT1与PAI-1启动子区域相结合 | 第58-60页 |
| ·SIRT1通过影响PAI-1启动子区组蛋白H4乙酰化水平来调控PAI-1表达 | 第60-64页 |
| 讨论 | 第64-70页 |
| 1. 结论概述 | 第64页 |
| 2. 选择内皮细胞作为研究对象的原因：针对性强、作用核心 | 第64页 |
| 3. SIRT1在内皮细胞衰老中的作用探讨 | 第64-65页 |
| 4. SIRT1在体内抑制小鼠血管自然老化的探讨 | 第65-66页 |
| 5. SIRT1在一定程度上通过下调PAI-1来发挥其抗衰老的保护性作用 | 第66-67页 |
| 6. SIRT1通过表观遗传的方式下调PAI-1表达 | 第67页 |
| 7. 本研究的不足与展望 | 第67-70页 |
| Summary | 第70页 |
| 小结 | 第70-71页 |
| 参考文献 | 第71-76页 |
| 文献综述 | 第76-91页 |
| Reference | 第87-91页 |
| 英文名词及缩写 | 第91-92页 |
| 致谢 | 第92-93页 |
| 个人简历 | 第93-99页 |
