| 摘要 | 第6-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 英文缩略表 | 第16-17页 |
| 第一章 引言 | 第17-26页 |
| 1.1 研究背景 | 第17-18页 |
| 1.1.1 氮素污染现状 | 第17页 |
| 1.1.2 氮素污染来源与危害 | 第17-18页 |
| 1.2 生物脱氮技术 | 第18页 |
| 1.2.1 传统生物脱氮 | 第18页 |
| 1.2.2 生物脱氮方法研究进展 | 第18页 |
| 1.3 好氧反硝化脱氮研究进展 | 第18-21页 |
| 1.3.1 好氧反硝化作用脱氮机理 | 第18-20页 |
| 1.3.2 好氧反硝化菌研究进展 | 第20页 |
| 1.3.3 好氧反硝化的影响因素 | 第20-21页 |
| 1.4 好氧反硝化相关酶研究进展 | 第21-23页 |
| 1.4.1 硝酸还原酶(nitrate reductase,NAR) | 第21-22页 |
| 1.4.2 亚硝酸还原酶（nitrite reductase,NIR） | 第22页 |
| 1.4.3 NO 还原酶（nitric oxide reductase,NOR） | 第22页 |
| 1.4.4 N_2O 还原酶（nitrous oxide reductase,NOS） | 第22-23页 |
| 1.5 实时荧光定量PCR（qRT-PCR） | 第23-24页 |
| 1.5.1 SYBRGreenⅠ法 | 第23页 |
| 1.5.2 TaqMan探针法 | 第23-24页 |
| 1.6 本研究目的和意义 | 第24页 |
| 1.7 研究内容和技术路线 | 第24-26页 |
| 1.7.1 研究内容 | 第24-25页 |
| 1.7.2 技术路线 | 第25-26页 |
| 第二章 好氧反硝化途径关键酶基因的克隆 | 第26-53页 |
| 2.1 实验材料与仪器 | 第26-27页 |
| 2.1.1 实验材料 | 第26页 |
| 2.1.2 实验仪器 | 第26-27页 |
| 2.2 实验方法 | 第27-33页 |
| 2.2.1 细菌基因组DNA的提取 | 第27页 |
| 2.2.2 质粒DNA的提取 | 第27-28页 |
| 2.2.3 制备E.coli JM110感受态细胞 | 第28页 |
| 2.2.4 DNA片段的凝胶回收 | 第28页 |
| 2.2.5 TA克隆的连接转化 | 第28-29页 |
| 2.2.6 周质硝酸还原酶基因（napA）的克隆 | 第29-30页 |
| 2.2.7 一氧化氮还原酶基因（norB）的克隆 | 第30-31页 |
| 2.2.8 氧化亚氮还原酶基因（nosZ）保守区的克隆 | 第31-32页 |
| 2.2.9 氧化亚氮还原酶基因（nosZ）全序列的克隆 | 第32页 |
| 2.2.10 DNA序列测定及分析 | 第32页 |
| 2.2.11 其他方法 | 第32-33页 |
| 2.3 结果与分析 | 第33-53页 |
| 2.3.1 周质硝酸还原酶基因（napA）的克隆与序列分析 | 第33-39页 |
| 2.3.2 一氧化氮还原酶基因（norB）的克隆与序列分析 | 第39-46页 |
| 2.3.3 氧化亚氮还原酶基因（nosZ）的克隆与序列分析 | 第46-53页 |
| 第三章 亚硝酸还原酶基因（nir）和氧化亚氮还原酶基因（nosZ）原核表达和酶学性质研究 | 第53-66页 |
| 3.1 引言 | 第53页 |
| 3.2 实验材料与仪器 | 第53-54页 |
| 3.2.1 实验材料 | 第53页 |
| 3.2.2 实验仪器 | 第53-54页 |
| 3.3 实验方法 | 第54-58页 |
| 3.3.1 亚硝酸还原酶原核表达载体构建示意图 | 第54页 |
| 3.3.2 亚硝酸还原酶原核表达载体的构建 | 第54-55页 |
| 3.3.3 SDS-PAGE分析鉴定含pET32a-nir重组菌株诱导表达产物 | 第55-56页 |
| 3.3.4 Western blotting分析鉴定含pET32a-nir重组菌株诱导表达产物 | 第56页 |
| 3.3.5 亚硝酸盐还原酶性质测定 | 第56-57页 |
| 3.3.6 氧化亚氮还原酶原核表达载体构建 | 第57-58页 |
| 3.3.7 SDS-PAGE分析鉴定含pET32a-nosZ重组菌株诱导表达产物 | 第58页 |
| 3.3.8 考马斯亮蓝法（Bradford法）测定含pET32a-nosZ重组菌株诱导可溶性蛋白浓度 | 第58页 |
| 3.4 结果与分析 | 第58-64页 |
| 3.4.1 亚硝酸还原酶原核表达载体构建 | 第58-59页 |
| 3.4.2 SDS-PAGE分析鉴定含pET32a-nir重组菌株表达产物 | 第59-60页 |
| 3.4.3 Western blotting分析鉴定含pET32a-nir重组菌株表达产物 | 第60页 |
| 3.4.4 亚硝酸盐还原酶酶学性质测定 | 第60-62页 |
| 3.4.5 氧化亚氮还原酶原核表达载体构建并验证 | 第62-63页 |
| 3.4.6 SDS-PAGE分析鉴定含pET32a-nosZ重组菌株诱导表达产物 | 第63-64页 |
| 3.4.7 考马斯亮蓝法（Bradford法）测定含pET32a-nosZ重组菌株诱导可溶性蛋白浓度 | 第64页 |
| 3.5 小结 | 第64-66页 |
| 第四章 不同培养条件对亚硝酸还原酶基因（nir）表达的影响 | 第66-74页 |
| 4.1 引言 | 第66页 |
| 4.2 实验材料与仪器 | 第66-67页 |
| 4.2.1 实验材料 | 第66页 |
| 4.2.2 实验仪器 | 第66-67页 |
| 4.3 实验方法 | 第67-69页 |
| 4.3.1 nir和内标基因 16S rRNA特异引物设计 | 第67页 |
| 4.3.2 样品总RNA的提取 | 第67页 |
| 4.3.3 引物特异性分析 | 第67-68页 |
| 4.3.4 nir和内标基因 16S rRNA标准曲线的制备 | 第68页 |
| 4.3.5 NP1菌株在不同培养基条件下的培养 | 第68页 |
| 4.3.6 样品总RNA的提取以及nir和内标基因 16S r RNA的RT-PCR扩增 | 第68-69页 |
| 4.4 结果与分析 | 第69-73页 |
| 4.4.1 样品总RNA的提取 | 第69页 |
| 4.4.2 引物特异性分析 | 第69-70页 |
| 4.4.3 nir和 16S r RNA基因的标准曲线 | 第70-71页 |
| 4.4.4 不同培养基条件下nir和 16S rRNA基因表达差异分析 | 第71-73页 |
| 4.4.4.1 样品总 RNA 的提取 | 第71-72页 |
| 4.4.4.2 样品的qRT-PCR分析 | 第72-73页 |
| 4.5 小结 | 第73-74页 |
| 第五章 全文结论 | 第74-76页 |
| 5.1 周质硝酸还原酶基因的克隆及基因、基因产物的分析 | 第74页 |
| 5.2 一氧化氮还原酶基因的克隆及基因、基因产物的分析 | 第74页 |
| 5.3 氧化亚氮还原酶基因的克隆及基因、基因产物的分析 | 第74-75页 |
| 5.4 亚硝酸还原酶基因的原核表达和酶学性质研究 | 第75页 |
| 5.5 氧化亚氮还原酶基因的原核表达 | 第75页 |
| 5.6 不同培养条件对亚硝酸还原酶基因（nir）表达的影响 | 第75-76页 |
| 参考文献 | 第76-82页 |
| 附录 | 第82-83页 |
| 致谢 | 第83-84页 |
| 作者简历 | 第84页 |
