| 第一章 本论文立题依据 | 第14-22页 |
| 第二章 人源化噬菌体单链抗体库的构建 | 第22-44页 |
| 一、 实验材料 | 第24-25页 |
| 1.1 实验试剂 | 第24页 |
| 1.2 主要仪器 | 第24页 |
| 1.3 溶液配制 | 第24-25页 |
| 二、 实验方法 | 第25-32页 |
| 1 、 嵌合单链抗体的重链的合成 | 第25-32页 |
| 1.1 合成片段的磷酸化 | 第25页 |
| 1.2 重链的合成 | 第25-27页 |
| 1.3 轻链的合成 | 第27-28页 |
| 1.4 单链抗体(ScFv)的合成 | 第28-31页 |
| 1.5 ScFv克隆于噬菌粒载体pFUW-80 | 第31-32页 |
| 三、 结果与讨论 | 第32-41页 |
| 1 、 结果 | 第32-39页 |
| 1.1 人源化单链抗体2F3重链(2F3V_H)的设计 | 第32-33页 |
| 1.2 人源化单链抗体2F3轻链(2F3V_L)的设计 | 第33-35页 |
| 1.3 重链基因的合成 | 第35-36页 |
| 1.4 轻链基因的合成 | 第36-37页 |
| 1.5 ScFv的合成 | 第37-39页 |
| 1.6 ScFv基因克隆于噬菌粒载体pFUW-80 | 第39页 |
| 2 、 讨论 | 第39-41页 |
| 2.1 人源化抗体FR模板的选择 | 第40页 |
| 2.2 确定需要保留的重要鼠源残基 | 第40-41页 |
| 四、 小结 | 第41-42页 |
| 参考文献 | 第42-44页 |
| 第三章 特异性噬菌体抗体的筛选 | 第44-65页 |
| 一、 实验材料 | 第44-45页 |
| 1.1 实验试剂 | 第44页 |
| 1.2 主要仪器 | 第44-45页 |
| 二、 实验方法 | 第45-53页 |
| 2.1 半抗原和全抗原的合成 | 第45-46页 |
| 2.2 噬菌体抗体库的库容和筛选前抗体库多样性的验证 | 第46-47页 |
| 2.3 辅助噬菌体M13K07的制备 | 第47-48页 |
| 2.4 重组人源化单链抗体库的扩增及亚库的制备 | 第48-49页 |
| 2.5 特异性单链抗体的筛选 | 第49-51页 |
| 2.6 噬菌体单链抗体的表达 | 第51-52页 |
| 2.7 噬菌体单链抗体的ELISA鉴定 | 第52页 |
| 2.8 ELISA法测定抗原-抗体解离常数 | 第52页 |
| 2.9 单链抗体的双酶切和基因序列分析鉴定 | 第52-53页 |
| 2.10 筛选后抗体库多样性的验证 | 第53页 |
| 三、 结果与讨论 | 第53-62页 |
| 1 、 结果 | 第53-60页 |
| 1.1 半抗原的表征 | 第53-55页 |
| 1.2 抗体库的库容及筛选前后抗体库多样性的验证 | 第55-57页 |
| 1.3 GSH-S-DNP-Bu和GSH-S-DNP-Me特异的噬菌体抗体的筛选与鉴定 | 第57-59页 |
| 1.4 抗原-抗体解离常数的测定 | 第59页 |
| 1.5 单链抗体的酶切鉴定和基因序列分析 | 第59-60页 |
| 2 、 讨论 | 第60-62页 |
| 2.1 半抗原设计 | 第60-61页 |
| 2.2 人源化抗体库 | 第61-62页 |
| 四、 小结 | 第62-63页 |
| 参考文献 | 第63-65页 |
| 第四章 高亲和力噬菌体抗体的筛选 | 第65-73页 |
| 一、 实验材料 | 第65-66页 |
| 1.1 实验试剂 | 第65页 |
| 1.2 主要仪器 | 第65-66页 |
| 二、 实验方法 | 第66-68页 |
| 2.1 无性PCR引入随机突变 | 第66页 |
| 2.2 有性PCR重组单链抗体基因 | 第66-67页 |
| 2.3 单链抗体基因的双酶切 | 第67页 |
| 2.4 ScFv基因与载体pFUW-80的连接 | 第67页 |
| 2.5 TG1感受态细胞的制备及质粒的转化 | 第67-68页 |
| 2.6 库容量的分析与转化子的鉴定 | 第68页 |
| 2.7 次级库的扩增与亲和筛选 | 第68页 |
| 2.8 阳性克隆的检测及表观解离常数的测定 | 第68页 |
| 三、 结果与讨论 | 第68-71页 |
| 1 、 结果 | 第68-71页 |
| 1.1 实验方案 | 第68-69页 |
| 1.2 次级库的验证 | 第69-70页 |
| 1.3 筛选结果 | 第70-71页 |
| 2 、 讨论 | 第71页 |
| 四、 小结 | 第71-72页 |
| 参考文献 | 第72-73页 |
| 第五章 单链抗体的表达与纯化 | 第73-93页 |
| 一、 实验材料 | 第73-74页 |
| 1.1 实验试剂 | 第73页 |
| 1.2 主要仪器 | 第73页 |
| 1.3 溶液的配制 | 第73-74页 |
| 二、 实验方法 | 第74-80页 |
| 2.1 单链抗体基因的扩增 | 第74-75页 |
| 2.2 双酶切PCR产物和pPe1B质粒 | 第75页 |
| 2.3 表达菌株的构建 | 第75-76页 |
| 2.4 连接产物的转化 | 第76页 |
| 2.5 重组质粒的鉴定 | 第76-77页 |
| 2.6 全菌SDS-PAGE蛋白电泳鉴定表达的单链抗体 | 第77页 |
| 2.7 表达条件的优化 | 第77-78页 |
| 2.8 单链抗体的纯化 | 第78页 |
| 2.9 纯化的单链抗体的鉴定 | 第78-80页 |
| 三、 结果与讨论 | 第80-90页 |
| 1 、 结果 | 第80-89页 |
| 1.1 单链抗体基因的扩增及重组质粒的鉴定 | 第80-83页 |
| 1.2 单链抗体的表达及表达条件的优化 | 第83-86页 |
| 1.3 单链抗体的纯化及鉴定 | 第86-89页 |
| 2 、 讨论 | 第89-90页 |
| 四、 小结 | 第90-91页 |
| 参考文献 | 第91-93页 |
| 第六章 具有GPX活力的单链抗体酶的制备及酶学性质 | 第93-107页 |
| 一、 实验材料 | 第93-94页 |
| 1.1 实验试剂 | 第93页 |
| 1.2 主要仪器 | 第93-94页 |
| 二、 实验方法 | 第94-96页 |
| 2.1 单链抗体的硒化 | 第94-95页 |
| 2.2 过氧化氢浓度的测定 | 第95页 |
| 2.3 GPX活力测定 | 第95页 |
| 2.4 硒含量的测定 | 第95-96页 |
| 2.5 结合常数的测定 | 第96页 |
| 2.6 酶反应动力学的研究 | 第96页 |
| 三、 结果与讨论 | 第96-104页 |
| 1 、 结果 | 第97-102页 |
| 1.1 单链抗体酶的化学诱变和GPX活力测定 | 第97-98页 |
| 1.2 含硒单链抗体酶与GSH结合常数的测定 | 第98-99页 |
| 1.3 含硒单链抗体酶的最适pH和最适温度 | 第99-100页 |
| 1.4 单链抗体酶的稳态动力学性质 | 第100-102页 |
| 2 、 讨论 | 第102-104页 |
| 四、 小结 | 第104页 |
| 参考文献 | 第104-107页 |
| 第七章 文献综述 | 第107-144页 |
| 一、 硒的生物学功能与含硒蛋白 | 第107-109页 |
| 1 硒的生物学效应 | 第107-108页 |
| 1.1 非酶学体系的抗氧化作用 | 第107-108页 |
| 1.2 酶学体系的抗氧化作用 | 第108页 |
| 2 、 含硒蛋白的生物学功能 | 第108-109页 |
| 二、 谷胱甘肽过氧化物酶(GPX) | 第109-117页 |
| 1 GPX的生物学作用 | 第109-110页 |
| 2 GPX的结构 | 第110-117页 |
| 2.1 牛cGPX的二级结构 | 第110-111页 |
| 2.2 牛cGPX的活性中心的结构 | 第111-112页 |
| 2.3 人pGPX的活性中心的结构 | 第112-113页 |
| 2.4 GPX的催化机制 | 第113-116页 |
| 2.5 硒代半胱氨酸在蛋白质合成中的掺入 | 第116-117页 |
| 三、 GPX的人工模拟 | 第117-122页 |
| 1 Ebselen及其衍生物 | 第117-119页 |
| 2 硒化环糊精 | 第119页 |
| 3 硒代谷胱甘肽(GSeH) | 第119页 |
| 4 硒化枯草杆菌蛋白酶 | 第119-120页 |
| 5 含硒抗体酶 | 第120-121页 |
| 6 制备人源化抗体的方法 | 第121-122页 |
| 四、 噬菌体抗体库 | 第122-132页 |
| 1 噬菌体抗体库技术 | 第122-125页 |
| 1.1 抗体可变区基因的扩增 | 第123-124页 |
| 1.2 载体 | 第124-125页 |
| 2 噬菌体抗体库的筛选 | 第125-127页 |
| 2.1 宿主直接洗脱 | 第125-126页 |
| 2.2 双层膜筛选系统 | 第126页 |
| 2.3 筛选抗细胞表面抗原抗体 | 第126页 |
| 2.4 体内筛选 | 第126-127页 |
| 3 高亲和力抗体制备 | 第127-130页 |
| 3.1 从大库容噬菌体抗体库或免疫库直接获得亲和力抗体 | 第127页 |
| 3.2 建立次级噬菌体抗体库完成抗体亲和力成熟 | 第127-130页 |
| 4 噬菌体抗体库的应用 | 第130-132页 |
| 4.1 医学微生物学研究 | 第130页 |
| 4.2 抗原表位分析 | 第130-131页 |
| 4.3 肿瘤研究 | 第131页 |
| 4.4 自身免疫性疾病的研究 | 第131-132页 |
| 参考文献 | 第132-144页 |
| 作者简介 | 第144-146页 |
| 致谢 | 第146-148页 |
| 中文摘要 | 第148-151页 |
| ABSTRACT | 第151页 |
