| 摘要 | 第11-13页 |
| ABSTRACT | 第13-15页 |
| 主要缩略语表 | 第16-17页 |
| 第一章 文献综述 | 第17-42页 |
| 1 糙皮侧耳的遗传特性及生活史 | 第17-18页 |
| 2 糙皮侧耳重要应用价值 | 第18-21页 |
| 2.1 营养价值和药用价值 | 第18-19页 |
| 2.2 在环境保护方面的应用 | 第19-20页 |
| 2.3 在工业方面的应用 | 第20-21页 |
| 3 糙皮侧耳分子生物学研究 | 第21-25页 |
| 3.1 糙皮侧耳发育相关基因的获得 | 第21-23页 |
| 3.2 糙皮侧耳功能基因的研究状况 | 第23-25页 |
| 4 高等真菌的遗传转化研究进展 | 第25-32页 |
| 4.1 PEG-LiCl/PEG-CaCl2 介导的遗传转化 | 第25-26页 |
| 4.2 电击转化法 | 第26页 |
| 4.3 基因枪法 | 第26页 |
| 4.4 限制性酶介导的整合法 | 第26-27页 |
| 4.5 冲击波介导的遗传转化 | 第27页 |
| 4.6 根癌农杆菌介导的高等真菌遗传转化 | 第27-32页 |
| 4.6.1 根癌农杆菌介导的高等真菌转化机理及特点 | 第28-30页 |
| 4.6.2 根癌农杆菌介导真菌转化的影响因素 | 第30-31页 |
| 4.6.3 根癌农杆菌介导高等真菌遗传转化的应用前景 | 第31-32页 |
| 5 高等真菌基因功能研究方法 | 第32-40页 |
| 5.1 甘油醛3磷酸脱氢酶基因启动子 | 第32-33页 |
| 5.2 基因敲除技术 | 第33-34页 |
| 5.3 超表达技术 | 第34-35页 |
| 5.4 RNA干涉技术 | 第35-40页 |
| 5.4.1 RNAi的分子机制 | 第35-36页 |
| 5.4.2 真菌中RNAi的不同途径及涉及的酶系 | 第36-38页 |
| 5.4.3 真菌中RNAi高效载体的构建 | 第38-39页 |
| 5.4.4 RNAi在真菌基因功能研究中的应用前景 | 第39-40页 |
| 5.5 其他方法 | 第40页 |
| 6 本课题研究目的意义及主要内容 | 第40-42页 |
| 第二章基于DGE文库的糙皮侧耳发育相关基因的筛选及克隆 | 第42-64页 |
| 1 材料与方法 | 第42-51页 |
| 1.1 菌株及质粒载体 | 第42页 |
| 1.2 主要试剂与设备 | 第42-44页 |
| 1.2.1 酶和生化试剂 | 第42-43页 |
| 1.2.2 主要仪器与设备 | 第43-44页 |
| 1.3 实验溶液与培养基的配制 | 第44页 |
| 1.4 实验方法 | 第44-51页 |
| 1.4.1 大肠杆菌DH5α 感受态细胞的制备 | 第44-45页 |
| 1.4.2 糙皮侧耳基因组DNA的提取 | 第45页 |
| 1.4.3 糙皮侧耳总RNA的提取 | 第45-46页 |
| 1.4.4 cDNA的反转录合成 | 第46-47页 |
| 1.4.5 双链cDNA的酶切 | 第47页 |
| 1.4.6 PCR反应体系及反应条件 | 第47-48页 |
| 1.4.7 PCR产物的纯化 | 第48-49页 |
| 1.4.8 PCR片段的连接及菌落PCR反应 | 第49-50页 |
| 1.4.9 部分基因 5′末端的克隆 | 第50-51页 |
| 2 结果与分析 | 第51-62页 |
| 2.1 糙皮侧耳菌丝体基因组DNA及总RNA的提取 | 第51-52页 |
| 2.2 部分Tag所对应基因的cDNA 3′端的克隆 | 第52-53页 |
| 2.3 部分Tag所对应基因的cDNA 3′端测序结果分析 | 第53-56页 |
| 2.4 部分糙皮侧耳菌丝体表达基因cDNA 5′端的克隆 | 第56-58页 |
| 2.5 部分糙皮侧耳菌丝体表达基因cDNA全长拼接 | 第58页 |
| 2.6 部分糙皮侧耳菌丝体表达基因DNA的克隆 | 第58-59页 |
| 2.7 部分糙皮侧耳菌丝体表达基因序列初步分析 | 第59-62页 |
| 3 讨论 | 第62-64页 |
| 3.1 数字基因表达谱文库 | 第62页 |
| 3.2 高表达量Tag对应基因的克隆 | 第62-63页 |
| 3.3 凝集素基因（Lectin） | 第63-64页 |
| 第三章 糙皮侧耳ASP和Mn-SOD基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达 | 第64-98页 |
| 1 材料与方法 | 第65-81页 |
| 1.1 实验材料 | 第65页 |
| 1.2 主要试剂和设备 | 第65-66页 |
| 1.2.1 酶和生化试剂 | 第65-66页 |
| 1.2.2 主要仪器与设备 | 第66页 |
| 1.3 实验溶液与培养基的配置 | 第66-68页 |
| 1.3.1 主要溶液的配制 | 第66-67页 |
| 1.3.2 主要培养基的配制 | 第67-68页 |
| 1.4 实验方法 | 第68-81页 |
| 1.4.1 毕赤酵母GS115 感受态细胞制备 | 第68-69页 |
| 1.4.2 引物设计 | 第69页 |
| 1.4.3 ASP和SOD基因CDS序列的分离 | 第69页 |
| 1.4.4 ASP和SOD基因毕赤酵母表达载体的构建 | 第69-71页 |
| 1.4.5 pPIC9K-ASP和pPIC9K-SOD质粒的线性化及电转化 | 第71-73页 |
| 1.4.6 毕赤酵母转化子的鉴定与筛选 | 第73-75页 |
| 1.4.7 毕赤酵母工程菌的培养和目标产物的诱导分泌表达 | 第75-76页 |
| 1.4.8 发酵液中蛋白含量的测定 | 第76页 |
| 1.4.9 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析 | 第76-77页 |
| 1.4.10 Western blot分析 | 第77-78页 |
| 1.4.11 重组天冬氨酸蛋白酶和锰超氧化物歧化酶的初步分离 | 第78-79页 |
| 1.4.12 天冬氨酸蛋白酶凝乳性质测定 | 第79页 |
| 1.4.13 锰超氧化物歧化酶酶学性质测定 | 第79-80页 |
| 1.4.14 毕赤酵母发酵条件的优化 | 第80-81页 |
| 2 结果与分析 | 第81-94页 |
| 2.1 ASP和SOD基因片段分离 | 第81页 |
| 2.2 ASP和SOD基因全序列分析 | 第81-82页 |
| 2.3 ASP和SOD基因生物信息学分析 | 第82-85页 |
| 2.4 ASP和SOD基因表达载体的构建 | 第85-87页 |
| 2.5 表达质粒转化Pichia pastoris GS115 及转化子的筛选 | 第87-89页 |
| 2.5.1 酵母转化子的甲醇利用表型的筛选 | 第87-88页 |
| 2.5.2 酵母转化子的PCR鉴定 | 第88-89页 |
| 2.5.3 ASP和Mn-SOD基因多拷贝整合子的筛选 | 第89页 |
| 2.6 ASP和Mn-SOD基因在P. pastoris中的表达及表达产物的检测 | 第89-91页 |
| 2.6.1 高表达酵母菌株的筛选 | 第89-90页 |
| 2.6.2 酵母工程菌表达产物的SDS-PAGE检测 | 第90-91页 |
| 2.6.3 酵母工程菌表达产物的Western blot检测 | 第91页 |
| 2.7 重组天冬氨酸蛋白酶和锰超氧化物歧化酶性质鉴定 | 第91-93页 |
| 2.7.1 重组天冬氨酸蛋白酶凝乳性质测定 | 第91-92页 |
| 2.7.2 锰超氧化物歧化酶的鉴定 | 第92-93页 |
| 2.8 重组锰超氧化物歧化酶酵母转化子发酵条件的优化 | 第93-94页 |
| 2.8.1 培养基起始pH对发酵的影响 | 第93页 |
| 2.8.2 诱导时间对发酵的影响 | 第93-94页 |
| 2.8.3 甲醇添加量对发酵的影响 | 第94页 |
| 3 讨论 | 第94-98页 |
| 3.1 巴斯德毕赤酵母表达系统的选择 | 第94-95页 |
| 3.2 分泌表达方式的选择 | 第95-96页 |
| 3.3 影响毕赤酵母外源蛋白表达量的因素及表达条件的优化 | 第96-98页 |
| 第四章 不同长度gpd启动子对其驱动效率的影响 | 第98-129页 |
| 1 材料与方法 | 第98-114页 |
| 1.1 菌株及质粒载体 | 第98-99页 |
| 1.2 主要试剂和设备 | 第99-100页 |
| 1.2.1 酶和生化试剂 | 第99-100页 |
| 1.2.2 主要实验设备 | 第100页 |
| 1.3 溶液和培养基的配制 | 第100-102页 |
| 1.3.1 主要溶液的配制 | 第100-102页 |
| 1.3.2 主要培养基的配制 | 第102页 |
| 1.4 实验方法 | 第102-114页 |
| 1.4.1 细菌感受态的制备及电转化 | 第102-103页 |
| 1.4.2 不同长度gpd启动子的克隆 | 第103-104页 |
| 1.4.3 中间载体pMD-egfp的构建 | 第104页 |
| 1.4.4 中间载体pMD-gpd-egfp的构建 | 第104-105页 |
| 1.4.5 表达载体pCAMBIA-gpd-egfp-hph的构建 | 第105-107页 |
| 1.4.6 pCAMBIA-gpd-egfp-hph质粒电转根癌农杆菌 | 第107页 |
| 1.4.7 根癌农杆菌介导的糙皮侧耳转化体系的构建 | 第107-108页 |
| 1.4.8 转化子的筛选及分子生物学分析 | 第108-111页 |
| 1.4.9 绿色荧光蛋白表达分析 | 第111-114页 |
| 2 结果与分析 | 第114-126页 |
| 2.1 糙皮侧耳gpd启动子转录调控位点分析 | 第114-115页 |
| 2.2 不同长度gpd启动子片段的克隆 | 第115-116页 |
| 2.3 中间载体pMD-egfp和pMD-gpd-egfp的构建 | 第116-117页 |
| 2.4 融合表达载体pCAMBIA-gpd-egfp-hph的构建 | 第117-119页 |
| 2.5 根癌农杆菌介导糙皮侧耳菌丝体的转化及筛选 | 第119-120页 |
| 2.5.1 抗生素敏感性测定 | 第119页 |
| 2.5.2 糙皮侧耳菌丝体的转化及筛选 | 第119-120页 |
| 2.6 糙皮侧耳菌丝体转化子的验证 | 第120-121页 |
| 2.6.1 转化子的稳定性及PCR筛选 | 第120-121页 |
| 2.6.2 转化子的Southern blot验证 | 第121页 |
| 2.7 不同长度gpd启动子片段驱动绿色荧光蛋白表达效率分析 | 第121-126页 |
| 2.7.1 荧光显微镜观察 | 第121-123页 |
| 2.7.2 荧光定量PCR分析 | 第123-124页 |
| 2.7.3 荧光值的测定 | 第124-125页 |
| 2.7.4 Western blot分析 | 第125-126页 |
| 3 讨论 | 第126-129页 |
| 3.1 根癌农杆菌介导真菌遗传转化条件的选择 | 第126-127页 |
| 3.2 不同长度gpd启动子对其驱动效率的影响 | 第127-129页 |
| 第五章 糙皮侧耳MsrA基因超表达及其抗逆性的研究 | 第129-157页 |
| 1 材料与方法 | 第129-140页 |
| 1.1 质粒载体 | 第129-131页 |
| 1.2 主要试剂和设备 | 第131页 |
| 1.3 溶液和培养基的配制 | 第131-132页 |
| 1.3.1 主要溶液的配制 | 第131-132页 |
| 1.3.2 主要培养基的配制 | 第132页 |
| 1.4 实验方法 | 第132-140页 |
| 1.4.1 糙皮侧耳甲硫氨酸亚砜还原酶A基因（PoMsrA）的克隆 | 第132页 |
| 1.4.2 表达中间载体pGEH的构建 | 第132-134页 |
| 1.4.3 表达载体pGEH-EM的构建 | 第134-137页 |
| 1.4.4 pGEH-EM质粒电转根癌农杆菌 | 第137-138页 |
| 1.4.5 根癌农杆菌介导的糙皮侧耳菌丝体转化 | 第138页 |
| 1.4.6 转化子的筛选及分子生物学鉴定 | 第138页 |
| 1.4.7 转基因菌株抗逆性实验 | 第138-139页 |
| 1.4.8 非生物胁迫条件下PoMsrA基因表达分析 | 第139页 |
| 1.4.9 不同生长阶段PoMsrA基因表达分析 | 第139-140页 |
| 2 结果与分析 | 第140-153页 |
| 2.1 糙皮侧耳PoMsrA基因的克隆 | 第140页 |
| 2.2 糙皮侧耳PoMsrA基因序列的生物信息学分析 | 第140-144页 |
| 2.3 糙皮侧耳PoMsrA基因超表达载体的构建 | 第144-147页 |
| 2.3.1 表达中间载体pGEH的构建 | 第144-146页 |
| 2.3.2 表达载体pGEH-EM的构建 | 第146-147页 |
| 2.4 根癌农杆菌介导糙皮侧耳菌丝体的转化及筛选 | 第147-150页 |
| 2.4.1 糙皮侧耳菌丝体的转化 | 第147-148页 |
| 2.4.2 转化子的PCR鉴定 | 第148-149页 |
| 2.4.3 转化子的Southern bot验证 | 第149-150页 |
| 2.4.4 转化子的荧光观察 | 第150页 |
| 2.5 转化子在不同逆境中的生长情况 | 第150-152页 |
| 2.6 不同胁迫条件下PoMsrA基因表达情况研究 | 第152-153页 |
| 2.7 不同生长阶段PoMsrA基因表达情况研究 | 第153页 |
| 3 讨论 | 第153-157页 |
| 3.1 甲硫氨酸亚砜还原酶A的结构 | 第153-154页 |
| 3.2 甲硫氨酸亚砜还原酶A的分布 | 第154-155页 |
| 3.3 甲硫氨酸亚砜还原酶A的功能 | 第155-157页 |
| 第六章 糙皮侧耳锰超氧化物歧化酶基因功能研究 | 第157-191页 |
| 1 材料与方法 | 第158-171页 |
| 1.1 质粒载体 | 第158-159页 |
| 1.2 主要试剂和设备 | 第159页 |
| 1.3 溶液和培养基的配制 | 第159页 |
| 1.4 实验方法 | 第159-171页 |
| 1.4.1 糙皮侧耳锰超氧化物歧化酶基因（PoMn-SOD）的克隆 | 第159-160页 |
| 1.4.2 中间载体pGEH的构建 | 第160页 |
| 1.4.3 表达载体pGEH-ES的构建 | 第160-162页 |
| 1.4.4 干涉载体pGEH-RI的构建 | 第162-168页 |
| 1.4.5 pGEH-EM和pGEH-RI质粒电转根癌农杆菌 | 第168页 |
| 1.4.6 根癌农杆菌介导的糙皮侧耳菌丝体转化 | 第168页 |
| 1.4.7 转化子的筛选及分子生物学鉴定 | 第168-169页 |
| 1.4.8 转基因菌株中PoMn-SOD基因表达分析 | 第169页 |
| 1.4.9 共沉默现象的验证 | 第169-170页 |
| 1.4.10 转基因菌株抗逆性实验 | 第170页 |
| 1.4.11 超表达菌株非生物胁迫条件下PoMn-SOD基因表达分析 .. 154 1.4.12 转基因菌株不同生长阶段PoMn-SOD基因表达分析 | 第170-171页 |
| 2 结果与分析 | 第171-188页 |
| 2.1 糙皮侧耳PoMn-SOD基因的克隆 | 第171页 |
| 2.2 糙皮侧耳PoMn-SOD基因序列生物信息学分析 | 第171-176页 |
| 2.3 糙皮侧耳PoMn-SOD基因超表达载体的构建 | 第176-178页 |
| 2.3.1 表达中间载体pGEH的构建 | 第176页 |
| 2.3.2 表达载体pGEH-EM的构建 | 第176-178页 |
| 2.4 糙皮侧耳PoMn-SOD基因RNA干涉载体的构建 | 第178-179页 |
| 2.5 根癌农杆菌介导糙皮侧耳菌丝体的转化及筛选 | 第179-183页 |
| 2.5.1 糙皮侧耳菌丝体的转化 | 第179-180页 |
| 2.5.2 转化子的PCR鉴定 | 第180-181页 |
| 2.5.3 转化子的Southern bot验证 | 第181页 |
| 2.5.4 转化子的荧光观察 | 第181-183页 |
| 2.6 转基因菌株中PoMn-SOD基因表达情况分析 | 第183-184页 |
| 2.6.1 转基因菌株中PoMn-SOD基因表达分析 | 第183页 |
| 2.6.2 RNA干涉引起的共沉默 | 第183-184页 |
| 2.7 转基因菌株的抗逆性研究 | 第184-187页 |
| 2.8 不同生长阶段转基因菌株中PoMn-SOD基因表达分析 | 第187-188页 |
| 3 讨论 | 第188-191页 |
| 3.1 RNA干涉效率 | 第188-189页 |
| 3.2 RNAi在真菌基因功能研究中的优缺点 | 第189-191页 |
| 第七章 结论与展望 | 第191-193页 |
| 1. 结论 | 第191-192页 |
| 2. 展望 | 第192页 |
| 3. 论文创新点 | 第192-193页 |
| 参考文献 | 第193-228页 |
| 附录1 DGE文库筛选相关引物 | 第228-233页 |
| 附录2 序列比对相关图 | 第233-236页 |
| 附录3 Mn-SOD基因序列 | 第236-238页 |
| 附录4 论文发表情况 | 第238-240页 |
| 致谢 | 第240-242页 |
