| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 详细摘要 | 第7-10页 |
| Detailed Abstract | 第10-14页 |
| 目录 | 第14-16页 |
| 1 前言 | 第16-34页 |
| ·选题的背景 | 第16-31页 |
| ·生物转化头孢菌素 C 的路径 | 第16-18页 |
| ·青霉素扩环酶简介 | 第18-24页 |
| ·扩环酶催化扩环反应的分子机制 | 第24-28页 |
| ·头孢类药物重要中间体 7‐ADCA 酶法生产的探索研究 | 第28-29页 |
| ·定向改造青霉素扩环酶的研究进展 | 第29-31页 |
| ·研究目的和意义 | 第31-32页 |
| ·研究内容和解决的关键性问题 | 第32页 |
| ·研究内容 | 第32页 |
| ·解决的关键性问题 | 第32页 |
| ·技术路线 | 第32-34页 |
| 2 材料方法 | 第34-44页 |
| ·实验材料 | 第34页 |
| ·实验仪器 | 第34-35页 |
| ·实验方法 | 第35-44页 |
| ·大肠杆菌的培养 | 第35页 |
| ·大肠杆菌质粒 DNA 的小量制备 | 第35页 |
| ·PCR 扩增反应 | 第35-36页 |
| ·PCR 反应的突变引物设计 | 第36-38页 |
| ·PCR 产物处理 | 第38页 |
| ·野生型和突变体的蛋白表达 | 第38-39页 |
| ·野生型和突变体的蛋白纯化 | 第39-40页 |
| ·SDS‐PAGE | 第40页 |
| ·蛋白浓度测定（Bradford 法） | 第40页 |
| ·青霉素扩环酶粗酶液的获得及对青霉素 G 的转化 | 第40页 |
| ·反应产物 G‐7‐ADCA 的生物检测（抑菌圈法） | 第40-41页 |
| ·底物青霉素 G 及反应产物 G‐7‐ADCA 的 HPLC 测定 | 第41页 |
| ·scDAOCS 对青霉素 G 的动力学参数及比活力的测定 | 第41-44页 |
| 3 定点突变改造棒状链霉菌青霉素扩环酶的新策略 | 第44-72页 |
| ·定点突变位点的选择 | 第46-49页 |
| ·利用多重序列比对选择突变位点 | 第46-48页 |
| ·利用 scDAOCS 与底物青霉素 G 晶体结构选择突变位点 | 第48-49页 |
| ·突变体的构建 | 第49-53页 |
| ·氨基酸的密码子 | 第49-51页 |
| ·重组定点突质粒的设计和构建 | 第51-53页 |
| ·野生型及突变株的转化及蛋白表达 | 第53-54页 |
| ·Bradford 法测定蛋白浓度中蛋白标准曲线的制定 | 第54-55页 |
| ·棒状链霉菌青霉素扩环酶的蛋白纯化 | 第55-59页 |
| ·野生型 scDAOCS 阴离子交换柱纯化（Resourse Q） | 第56-57页 |
| ·野生型 scDAOCS 的凝胶过滤层析（Supperdex 75） | 第57-58页 |
| ·突变体青霉素扩环酶的纯化 | 第58-59页 |
| ·底物青霉素 G 及产物 G‐7‐ADCA 的 HPLC 检测 | 第59-60页 |
| ·产物 G‐7‐ADCA 标准曲线的制定 | 第60页 |
| ·棒状链霉菌青霉素扩环酶催化青霉素 G 最佳反应时间的测定 | 第60-61页 |
| ·野生型及各个突变株比活力的测定 | 第61-63页 |
| ·野生型及各个突变株动力学参数的测定 | 第63-65页 |
| ·多重序列比对第二组定点突变株活性评价 | 第65-67页 |
| ·生物活性测定 | 第65-66页 |
| ·比活力的测定 | 第66-67页 |
| ·讨论 | 第67-71页 |
| ·小结 | 第71-72页 |
| 4 迭代组合突变改造棒状链霉菌青霉素扩环酶 | 第72-90页 |
| ·出发菌株及单点突变位点的选择 | 第75-76页 |
| ·野生型和突变株的异源表达和纯化 | 第76页 |
| ·迭代组合突变株酶比活力活性测定 | 第76-83页 |
| ·第一轮迭代组合突变株酶比活力活性测定 | 第78-79页 |
| ·第二轮迭代组合突变株酶比活力活性测定 | 第79-80页 |
| ·第三轮迭代组合突变株酶比活力活性测定 | 第80-81页 |
| ·第四轮迭代组合突变株酶比活力活性测定 | 第81-83页 |
| ·组合突变株动力学参数的测定 | 第83-84页 |
| ·讨论 | 第84-88页 |
| ·小结 | 第88-90页 |
| 5 基于结构信息学靶向突变改造棒状链霉菌青霉素扩环酶 | 第90-102页 |
| ·靶向突变位点的选择及突变偏向性 | 第91-94页 |
| ·突变库的建立 | 第94-96页 |
| ·生物活性检测法初步筛选突变库（抑菌圈法） | 第96-98页 |
| ·利用 HPLC 法进一步筛选突变库 | 第98-99页 |
| ·讨论 | 第99-100页 |
| ·小结 | 第100-102页 |
| 6 结论与展望 | 第102-106页 |
| ·结论 | 第102页 |
| ·论文创新点 | 第102-103页 |
| ·展望 | 第103-106页 |
| 参考文献 | 第106-114页 |
| 致谢 | 第114-116页 |
| 作者简介 | 第116-117页 |
| 攻读博士期间发表学术论文 | 第117页 |
| 在学期间参加科研项目 | 第117页 |
| 获得荣誉 | 第117页 |
