| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-16页 |
| 前言 | 第16-31页 |
| 1 O-GlcNAc 修饰 | 第16-21页 |
| ·O-GlcNAc 的生物合成 | 第16-17页 |
| ·OGT | 第17-19页 |
| ·O-GlcNAcase | 第19-20页 |
| ·O-GlcNAc 修饰的功能 | 第20-21页 |
| ·O-GlcNAc 修饰与转录调节 | 第20页 |
| ·O-GlcNAc 修饰与压力应激 | 第20-21页 |
| ·O-GlcNAc 与细胞周期和增值 | 第21页 |
| ·O-GlcNAc 与蛋白质间的相互作用 | 第21页 |
| 2 蛋白质 O-GlcNAc 修饰的检测 | 第21-25页 |
| ·凝集素检测法 | 第22页 |
| ·抗体检测法 | 第22-23页 |
| ·代谢标记法 | 第23-24页 |
| ·酶标记法 | 第24-25页 |
| 3 重组蛋白在原核细胞和体外的 O-GlcNAc 修饰 | 第25-26页 |
| 4 O-GlcNAc 修饰位点的确定 | 第26-31页 |
| ·凝集素富集法 | 第28页 |
| ·抗体富集法 | 第28页 |
| ·代谢标记和酶标记富集法 | 第28-29页 |
| ·BEMAD 富集法 | 第29-31页 |
| 第一章 O-GlcNAc 修饰的蛋白质的制备 | 第31-92页 |
| 第一节 建立重组蛋白在原核细胞 O-GlcNAc 修饰的方法 | 第31-50页 |
| 1 实验材料 | 第31-34页 |
| ·菌株和载体 | 第31页 |
| ·主要仪器 | 第31-32页 |
| ·主要试剂 | 第32-33页 |
| ·常用溶液的配制 | 第33-34页 |
| 2 实验方法 | 第34-42页 |
| ·构建 Sp1 与 OGT 的原核共表达菌株 | 第34-40页 |
| ·构建 Sp1 的原核表达载体 | 第34-39页 |
| ·碱裂解法提质粒 pET32a-Sp1 和 pET30a | 第34-35页 |
| ·限制性内切酶酶切 pET32a-Sp1 和 pET30a | 第35-36页 |
| ·DNA 片段的琼脂糖胶回收 | 第36页 |
| ·DNA 片段连接 | 第36页 |
| ·重组质粒的转化 | 第36-37页 |
| ·PCR 鉴定阳性克隆 | 第37-38页 |
| ·酶切鉴定重组质粒 pET30a-Sp1 | 第38-39页 |
| ·Sp1 的原核诱导表达 | 第39页 |
| ·Sp1 与 OGT 的原核共表达 | 第39-40页 |
| ·纯化 Sp1 | 第40页 |
| ·SDS-PAGE 电泳 | 第40-41页 |
| ·免疫印迹（Western Blot,WB） | 第41-42页 |
| 3 实验结果 | 第42-48页 |
| ·构建 Sp1 与 OGT 的原核共表达菌株 | 第42-46页 |
| ·构建 Sp1 的原核表达载体 | 第42-45页 |
| ·Sp1 的原核诱导表达 | 第45-46页 |
| ·Sp1 与 OGT 的原核共表达 | 第46页 |
| ·大肠杆菌 BL21(DE3)中 Sp1 的 O-GlcNAc 修饰 | 第46-48页 |
| 4 小结 | 第48页 |
| 5 讨论 | 第48-50页 |
| 第二节 重组 p120 在原核细胞的 O-GlcNAc 修饰 | 第50-67页 |
| 1 实验材料 | 第50-53页 |
| ·菌株和载体 | 第50页 |
| ·主要仪器 | 第50-51页 |
| ·主要试剂 | 第51-52页 |
| ·常用溶液的配制 | 第52-53页 |
| 2 实验方法 | 第53-58页 |
| ·构建 p120 与 OGT 的原核共表达菌株 | 第53-57页 |
| ·构建 p120 的原核表达载体 | 第54-56页 |
| ·PCR 扩增 p120 | 第54页 |
| ·p120 DNA 片段的琼脂糖胶回收 | 第54页 |
| ·p120 DNA 片段连 PMD-18T 载体并测序 | 第54-55页 |
| ·碱裂解法提质粒 PMD-18T-p120 | 第55页 |
| ·限制性内切酶酶切 PMD-18T-p120 和 pET30a | 第55-56页 |
| ·DNA 片段的琼脂糖胶回收 | 第56页 |
| ·DNA 片段连接 | 第56页 |
| ·重组质粒的转化 | 第56页 |
| ·PCR 鉴定阳性克隆 | 第56页 |
| ·酶切鉴定重组质粒 pET30a-p120 | 第56页 |
| ·p120 的原核诱导表达 | 第56页 |
| ·p120 与 OGT 的原核共表达 | 第56-57页 |
| ·纯化 p120 | 第57页 |
| ·SDS-PAGE 电泳 | 第57页 |
| ·免疫印迹（Western Blot,WB） | 第57-58页 |
| 3 实验结果 | 第58-65页 |
| ·构建 p120 与 OGT 的原核共表达菌株 | 第58-63页 |
| ·构建 p120 的原核表达载体 | 第58-62页 |
| ·p120 的原核诱导表达 | 第62-63页 |
| ·p120 和 OGT 的原核诱导表达 | 第63页 |
| ·大肠杆菌 BL21(DE3)中 p120 的 O-GlcNAc 修饰 | 第63-65页 |
| 4 小结 | 第65页 |
| 5 讨论 | 第65-67页 |
| 第三节 重组 p120 在原核细胞 O-GlcNAc 修饰的条件优化 | 第67-79页 |
| 1 实验材料 | 第67-71页 |
| ·菌株和细胞株 | 第67页 |
| ·主要仪器 | 第67-68页 |
| ·主要试剂 | 第68-69页 |
| ·常用溶液的配制 | 第69-71页 |
| 2 实验方法 | 第71-73页 |
| ·细胞复苏和冻存 | 第71页 |
| ·细胞培养与传代 | 第71-72页 |
| ·脂质体转染 | 第72页 |
| ·纯化原核和真核表达的 p120 | 第72页 |
| ·SDS-PAGE 电泳 | 第72页 |
| ·免疫印迹（Western Blot, WB） | 第72-73页 |
| 3 实验结果 | 第73-77页 |
| ·原核和真核表达的 p120 O-GlcNAc 修饰水平的差异 | 第73-74页 |
| ·不同培养条件对大肠杆菌 BL21(DE3)中 p120 O-GlcNAc 修饰的影响 | 第74-77页 |
| 4 小结 | 第77页 |
| 5 讨论 | 第77-79页 |
| 第四节 建立重组蛋白在体外 O-GlcNAc 修饰的方法 | 第79-85页 |
| 1 实验材料 | 第79-82页 |
| ·菌株和细胞株 | 第79页 |
| ·主要仪器 | 第79页 |
| ·主要试剂 | 第79-80页 |
| ·常用溶液的配制 | 第80-82页 |
| 2 实验方法 | 第82-83页 |
| ·体外 O-GlcNAc 修饰 | 第82-83页 |
| ·SDS-PAGE 电泳 | 第83页 |
| ·免疫印迹（Western Blot, WB） | 第83页 |
| 3 实验结果 | 第83-84页 |
| 4 小结 | 第84页 |
| 5 讨论 | 第84-85页 |
| 第五节 重组 p120 在体外的 O-GlcNAc 修饰 | 第85-92页 |
| 1 实验材料 | 第85-88页 |
| ·菌株和细胞株 | 第85页 |
| ·主要仪器 | 第85页 |
| ·主要试剂 | 第85-86页 |
| ·常用溶液的配制 | 第86-88页 |
| 2 实验方法 | 第88-89页 |
| ·体外 O-GlcNAc 修饰 | 第88-89页 |
| ·SDS-PAGE 电泳 | 第89页 |
| ·免疫印迹（Western Blot, WB） | 第89页 |
| 3 实验结果 | 第89-91页 |
| ·p120 的体外 O-GlcNAc 修饰 | 第89-90页 |
| ·p120 在真核细胞、在原核细胞和在体外的 O-GlcNAc 修饰水平的差异 | 第90-91页 |
| 4 小结 | 第91页 |
| 5 讨论 | 第91-92页 |
| 第二章 质谱确定 O-GlcNAc 修饰位点的方法探索 | 第92-113页 |
| 第一节 半胱氨酸封闭方法的确定 | 第92-100页 |
| 1 实验材料 | 第92-95页 |
| ·菌株 | 第92页 |
| ·主要仪器 | 第92页 |
| ·主要试剂 | 第92-93页 |
| ·常用溶液的配制 | 第93-95页 |
| 2 实验方法 | 第95-96页 |
| ·纯化 Sp1 | 第95页 |
| ·Sp1 和 BSA 的过甲酸氧化 | 第95页 |
| ·Sp1 和 BSA 的烷基化 | 第95-96页 |
| ·SDS-PAGE 电泳 | 第96页 |
| ·免疫印迹（Western Blot,WB） | 第96页 |
| 3 实验结果 | 第96-98页 |
| ·Sp1 和 BSA 的过甲酸氧化 | 第96-97页 |
| ·Sp1 和 BSA 的碘乙酰胺烷基化 | 第97-98页 |
| 4 小结 | 第98-99页 |
| 5 讨论 | 第99-100页 |
| 第二节 β消除条件的确定 | 第100-107页 |
| 1 实验材料 | 第100-102页 |
| ·菌株 | 第100页 |
| ·主要仪器 | 第100页 |
| ·主要试剂 | 第100-101页 |
| ·常用溶液的配制 | 第101-102页 |
| 2 实验方法 | 第102-103页 |
| ·纯化 Sp1 | 第102页 |
| ·Strong BEMAD 和 Mild BEMAD | 第102-103页 |
| ·SDS-PAGE 电泳 | 第103页 |
| ·免疫印迹（Western Blot,WB） | 第103页 |
| 3 实验结果 | 第103-105页 |
| ·Strong BEMAD 条件优化 | 第103-104页 |
| ·Mild BEMAD 条件优化 | 第104-105页 |
| 4 小结 | 第105页 |
| 5 讨论 | 第105-107页 |
| 第三节 BEMAD 结合硫醇柱富集的可行性分析 | 第107-113页 |
| 1 实验材料 | 第107-109页 |
| ·样品 | 第107页 |
| ·主要仪器 | 第107页 |
| ·主要试剂 | 第107-108页 |
| ·常用溶液的配制 | 第108-109页 |
| 2 实验方法 | 第109-111页 |
| ·纯化无 O-GlcNAc 修饰的 Sp1 | 第109页 |
| ·SDS-PAGE 电泳 Sp1 | 第109页 |
| ·胶内胰酶酶解 Sp1 | 第109-110页 |
| ·半胱氨酸的烷基化 | 第110页 |
| ·Mild BEMAD | 第110页 |
| ·硫醇柱富集 | 第110页 |
| ·Macro Spin-C18 反相柱除盐 | 第110-111页 |
| ·ESI 质谱分析 | 第111页 |
| 3 实验结果 | 第111-113页 |
| 4 小结 | 第113页 |
| 5 讨论 | 第113页 |
| 总结与展望 | 第113-114页 |
| 参考文献 | 第114-121页 |
| 致谢 | 第121-122页 |
| 个人简历 | 第122页 |
| 在读期间的学术成果 | 第122页 |
