| 缩写词简表 | 第1-12页 |
| 中文摘要 | 第12-15页 |
| 英文摘要 | 第15-19页 |
| 前言 | 第19-23页 |
| 技术路线 | 第23-26页 |
| 第一部分 Mipul融合蛋白的表达与纯化 | 第26-48页 |
| 一.材料和方法 | 第26-39页 |
| 1.材料 | 第26-27页 |
| ·层析树脂及设备 | 第26页 |
| ·试验菌株 | 第26页 |
| ·引物 | 第26-27页 |
| ·载体 | 第27页 |
| ·工具酶 | 第27页 |
| ·试剂盒 | 第27页 |
| ·培养基 | 第27页 |
| ·其它试剂 | 第27页 |
| 2.方法 | 第27-39页 |
| ·Mipul原核表达载体的构建 | 第27-34页 |
| ·Mipul ORF全长及其缺失突变片段的PCR制备 | 第27-30页 |
| ·Mipul ORF全长及其缺失突变表达质粒的构建 | 第30-34页 |
| ·PCR产物凝胶纯化回收 | 第30页 |
| ·载体与PCR产物的酶切纯化 | 第30-31页 |
| ·连接反应 | 第31-32页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第32页 |
| ·转化 | 第32页 |
| ·阳性克隆的鉴定 | 第32-34页 |
| ·Glutathione-Sepharose树脂的制备 | 第34页 |
| ·Zn~(2+)-Sepharose树脂的制备 | 第34-35页 |
| ·GST与Mipul及其缺失片段所构成的融合蛋白的表达与分离纯化 | 第35-36页 |
| ·GST与Mipul及其缺失片段所构成的融合蛋白的的表达 | 第35页 |
| ·LB培基的配制 | 第35页 |
| ·融合蛋白的诱导表达 | 第35页 |
| ·GST与Mipul及其缺失片段所构成的融合蛋白的分离纯化 | 第35-36页 |
| ·融合蛋白的抽提 | 第35页 |
| ·GST-Mipul的分离纯化 | 第35-36页 |
| ·融合蛋白GST-ZF、GST-ZF1及GST-ZF2的分离纯化 | 第36页 |
| ·带六个组氨酸Mipul(His-tagged Mipul)的表达与分离纯化 | 第36页 |
| ·His-tagged Mipul融合蛋白的表达 | 第36页 |
| ·His-tagged Mipul的粗提与纯化 | 第36页 |
| ·蛋白质的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第36-38页 |
| ·蛋白质的定量 | 第38页 |
| ·蛋白质相对分子质量的测定 | 第38-39页 |
| 二.结果 | 第39-45页 |
| 1.Mipul原核表达质粒的鉴定 | 第39-42页 |
| 2.融合蛋白GST-Mipul的表达与分离纯化 | 第42-43页 |
| 3.His-tagged Mipul融合蛋白的表达与分离纯化 | 第43-44页 |
| 4.Mipul融合蛋白相对分子质量的测定 | 第44-45页 |
| 三.讨论 | 第45-48页 |
| 第二部分 Mipul DNA结合位点的筛选与确定 | 第48-67页 |
| 一.材料和方法 | 第48-55页 |
| 1.材料 | 第48-49页 |
| ·同位素 | 第48页 |
| ·层析树脂 | 第48-49页 |
| ·寡核苷酸片段 | 第49页 |
| ·载体与菌株 | 第49页 |
| ·试剂盒 | 第49页 |
| ·其他试剂 | 第49页 |
| 2.方法 | 第49-55页 |
| ·GST-Mipul融合蛋白在Glutathione-Sepharose珠上的固定 | 第49-50页 |
| ·寡核苷酸文库的制备与PCR扩增 | 第50-51页 |
| ·寡核苷酸文库的筛选 | 第51页 |
| ·Mipul DNA结合位点的确定 | 第51-52页 |
| ·EMSA | 第52-54页 |
| ·探针的合成与标记 | 第52页 |
| ·标记探针与Mipul融合蛋白的结合、电泳分离及放射自显影 | 第52-54页 |
| ·标记探针与Mipul融合蛋白的结合反应 | 第52-53页 |
| ·非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备 | 第53页 |
| ·电泳分离及放射自显影 | 第53-54页 |
| ·Target detection assay实验 | 第54-55页 |
| ·融合蛋白的SDS-PAGE | 第54页 |
| ·融合蛋白转移至硝酸纤维素膜上(湿转式) | 第54页 |
| ·杂交及化学发光显影 | 第54-55页 |
| 二.结果 | 第55-62页 |
| 1 随机寡核苷酸文库的筛选 | 第55-56页 |
| 2 Mipul DNA结合位点的确定 | 第56-57页 |
| 3 EMSA验证GST-Mipul与其假定结合位点的结合作用 | 第57-59页 |
| 4 Target detection assay分析GST-Mipul与其假定结合位点的结合作用 | 第59-60页 |
| 5 Mipul的锌指结构与DNA结合功能的关系 | 第60-62页 |
| 三.讨论 | 第62-67页 |
| 1.随机寡核苷酸文库筛选与Mipul DNA结合位点确定 | 第62-63页 |
| 2.体外验证Mipul与其DNA结合位点的相互作用 | 第63-67页 |
| 第三部分 Miplu的转录抑制功能及可能受其调控的凋亡相关基因的初步筛选 | 第67-91页 |
| 一.材料和方法 | 第67-77页 |
| 1.材料 | 第67-68页 |
| ·细胞株 | 第67-68页 |
| ·细胞培养板与细胞培养试剂 | 第68页 |
| ·试剂盒 | 第68页 |
| ·寡核苷酸片段 | 第68页 |
| ·载体 | 第68页 |
| ·工具酶 | 第68页 |
| 2.方法 | 第68-77页 |
| ·Mipul真核表达载体的构建 | 第69-73页 |
| ·Mipul ORF全长、ORF+5’-非翻译区及其缺失突变片段的PCR制备 | 第69-71页 |
| ·Mipul ORF全长及其确实突变表达质粒的构建 | 第71-73页 |
| ·PCR产物凝胶纯化回收 | 第71页 |
| ·载体与PCR产物的酶切纯化 | 第71页 |
| ·连接反应 | 第71页 |
| ·转化、阳性克隆的鉴定 | 第71-73页 |
| ·报告基因载体的构建 | 第73-76页 |
| ·含Mipul DNA结合位点的寡核苷酸的制备 | 第73页 |
| ·报告基因载体和含Mipul DNA结合位点的寡核苷酸的酶切与连接 | 第73页 |
| ·阳性克隆的鉴定 | 第73页 |
| ·Mipul调控靶基因的生物信息学分析 | 第73-74页 |
| ·大鼠Bax启动子调控的报告基因的构建 | 第74-76页 |
| ·大鼠Bax启动子的制备 | 第74-75页 |
| ·大鼠Bax启动子的凝胶纯化 | 第75页 |
| ·大鼠Bax启动子与报告基因载体的酶切、连接 | 第75页 |
| ·重组报告基因质粒的鉴定 | 第75-76页 |
| ·荧光素酶活性的测定 | 第76页 |
| ·细胞培养与基因转染 | 第76页 |
| ·荧光素酶的活性测定 | 第76页 |
| ·Mipul蛋白的亚细胞定位 | 第76页 |
| ·大鼠Bax启动子与Mipul蛋白的相互作用 | 第76-77页 |
| 二.结果 | 第77-87页 |
| 1.Mipul真核表达质粒的鉴定 | 第77-79页 |
| 2.报告基因质粒的鉴定 | 第79-81页 |
| 3.Mipul的过表达对含其结合位点的启动子具有调控作用 | 第81-83页 |
| 4.Mipul蛋白定位于核 | 第83-84页 |
| 5.Mipul候选靶基因的初步筛选 | 第84-86页 |
| 6.Mipul蛋白与Bax启动子的体外结合作用 | 第86-87页 |
| 三.讨论 | 第87-91页 |
| 结论 | 第91-92页 |
| 参考文献 | 第92-99页 |
| 综述 | 第99-115页 |
| 攻读学位期间发表的主要论文 | 第115-116页 |
| 致谢 | 第116页 |
