| 摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 第一章 绪论 | 第7-22页 |
| 1．1 纤维素酶的性质、结构、功能及用途 | 第7-14页 |
| 1．1．1 纤维素及纤维素酶 | 第7-9页 |
| 1．1．2 纤维素酶的研究进展 | 第9-10页 |
| 1．1．3 纤维素酶的性质及酶系的作用机制 | 第10-11页 |
| 1．1．4 纤维素酶的分子结构与功能及其催化的分子机制 | 第11-13页 |
| 1．1．5 纤维素酶的应用 | 第13-14页 |
| 1．2 纤维素内切葡聚糖酶 EGⅢ表达研究的现状 | 第14-15页 |
| 1．3 巴斯德毕赤氏酵母表达系统 | 第15-21页 |
| 1．3．1 表达系统的选择 | 第15-16页 |
| 1．3．2 表达载体的构成 | 第16-18页 |
| 1．3．2．1 启动子 | 第16-17页 |
| 1．3．2．2 筛选标记 | 第17页 |
| 1．3．2．3 其他序列 | 第17-18页 |
| 1．3．3 表达载体与宿主染色体的整合 | 第18-19页 |
| 1．3．4 外源基因在甲醇营养型酵母中的分泌表达 | 第19-20页 |
| 1．3．4．1 外源基因分泌表达的必要性 | 第19-20页 |
| 1．3．4．2 分泌信号肽序列 | 第20页 |
| 1．3．5 巴斯德毕赤氏酵母表达系统的应用前景 | 第20-21页 |
| 1．4 本论文的研究目的和意义 | 第21-22页 |
| 第二章 纤维素内切酶 EGⅢ在 Pichia pastoris中的表达 | 第22-44页 |
| 2．1 导言 | 第22-23页 |
| 2．2 实验材料 | 第23-26页 |
| 2．2．1 菌株和质粒 | 第23页 |
| 2．2．2 分子克隆用酶和试剂 | 第23页 |
| 2．2．3 培养基和溶液 | 第23-26页 |
| 2．3 实验方法 | 第26-38页 |
| 2．3．1 菌株的活化培养 | 第26页 |
| 2．3．2 目的基因PCR模板的 SDS裂解法制备 | 第26-27页 |
| 2．3．3 目的基因EGⅢ的PCR扩增 | 第27-28页 |
| 2．3．4 目的基因片段的回收 | 第28页 |
| 2．3．5 重组质粒 pPIC9K-EGⅢ的构建 | 第28-29页 |
| 2．3．6 琼脂糖凝胶电泳 | 第29页 |
| 2．3．7 大肠杆菌电转化 | 第29-30页 |
| 2．3．8 大肠杆菌重组子的鉴定 | 第30-31页 |
| 2．3．9 转化酵母重组质粒的线性化 | 第31页 |
| 2．3．10 毕赤氏酵母电转化 | 第31-32页 |
| 2．3．11 酵母表达菌株基因组 DNA的提取 | 第32-33页 |
| 2．3．12 酵母阳性转化子的PCR检测 | 第33-34页 |
| 2．3．13 外源基因在酵母中的表达与检测 | 第34页 |
| 2．3．14 内切葡聚糖酶活性测定 | 第34-38页 |
| 2．4 结果与讨论 | 第38-44页 |
| 2．4．1 目的基因EGⅢ PCR扩增引物设计 | 第38-39页 |
| 2．4．2 重组质粒 pPIC9K-EGⅢ的构建 | 第39-42页 |
| 2．4．3 重组质粒向E．coli JM109中的转化 | 第42页 |
| 2．4．4 重组子的筛选及重组质粒的验证 | 第42-43页 |
| 2．4．5 毕赤氏酵母电转化及重组酵母菌的筛选 | 第43页 |
| 2．4．6 重组基因产物在毕赤氏酵母中的表达 | 第43页 |
| 2．4．7 重组基因产物的分析鉴定 | 第43-44页 |
| 2．4．8 内切葡聚糖酶酶活测定 | 第44页 |
| 第三章 毕赤氏酵母工程菌 EGⅢ基因拷贝数与表达能力的研究 | 第44-61页 |
| 3．1 导言 | 第44-46页 |
| 3．2 实验材料 | 第46-47页 |
| 3．3 实验方法 | 第47-51页 |
| 3．4 结果与讨论 | 第51-61页 |
| 3．4．1 卡那霉素G418确定单拷贝菌株和多拷贝菌株 | 第51-53页 |
| 3．4．2 多拷贝菌株拷贝数确定结果 | 第53-59页 |
| 3．4．3 不同拷贝数菌株的摇瓶发酵 | 第59-61页 |
| 第四章 EGⅢ吸附催化动力学研究 | 第61-76页 |
| 4．1 导言 | 第61-62页 |
| 4．2 纤维素酶吸附催化动力学研究理论背景和实验方法 | 第62-70页 |
| 4．3 实验结果和讨论 | 第70-76页 |
| 4．3．1 微晶纤维素吸附表面积测定 | 第70-71页 |
| 4．3．2 催化动力学研究结果 | 第71-73页 |
| 4．3．3 吸附动力学研究结果 | 第73-76页 |
| 参考文献 | 第76-81页 |
| 致谢 | 第81页 |
