| 中文摘要 | 第1-10页 |
| 英文摘要 | 第10-12页 |
| 前言 | 第12-14页 |
| 论文 | 第14-76页 |
| 第一章 低温胁迫对播娘蒿和紫花苜蓿生理的影响 | 第14-27页 |
| 1 试验材料 | 第14-16页 |
| 1．1 材料和处理 | 第14-15页 |
| 1．2 仪器设备 | 第15页 |
| 1．3 试剂 | 第15-16页 |
| 2 试验方法 | 第16-19页 |
| 2．1 叶片SOD酶活性测定 | 第16-18页 |
| 2．1．1 优化光照时间 | 第16页 |
| 2．1．2 酶液的提取 | 第16-17页 |
| 2．1．3 显色反应 | 第17页 |
| 2．1．4 SOD活性的测定与结果计算 | 第17-18页 |
| 2．2 叶片脯氨酸含量测定 | 第18-19页 |
| 2．2．1 标准曲线的制备 | 第18页 |
| 2．2．2 脯氨酸的提取 | 第18-19页 |
| 2．2．3 脯氨酸含量测定 | 第19页 |
| 2．3 叶片电导率的测定 | 第19页 |
| 3 结果 | 第19-24页 |
| 3．1 不同光照时间对氮蓝四唑显色反应的影响 | 第19-20页 |
| 3．2 低温胁迫对叶片 SOD酶活性影响 | 第20-21页 |
| 3．3 低温胁迫对叶片脯氨酸含量的影响 | 第21-23页 |
| 3．4 低温胁迫对紫花苜蓿叶片电导率的影响 | 第23-24页 |
| 4 讨论 | 第24-27页 |
| 4．1 低温胁迫与 SOD活性的关系 | 第24-25页 |
| 4．2 低温胁迫与脯氨酸含量的关系 | 第25-26页 |
| 4．3 冰冻胁迫与质膜伤害的关系 | 第26-27页 |
| 第二章 播娘蒿 CBF基因 EST序列克隆和3’末端序列扩增 | 第27-39页 |
| 1 试验材料 | 第27-28页 |
| 1．1 实验植株 | 第27页 |
| 1．2 实验用试剂盒、工具酶 | 第27-28页 |
| 1．3 试剂 | 第28页 |
| 1．4 引物的合成 | 第28页 |
| 2 试验方法 | 第28-31页 |
| 2．1 播娘蒿总 RNA提取 | 第28页 |
| 2．2 播娘蒿 CBF基因 EST序列的同源克隆 | 第28-30页 |
| 2．2．1 播娘蒿 CBF基因同源克隆简并引物的设计 | 第28-29页 |
| 2．2．2 播娘蒿 CBF基因EST的克隆 | 第29-30页 |
| 2．3 播娘蒿 CBF基因3’RACE扩增 | 第30-31页 |
| 3 结果与分析 | 第31-34页 |
| 3．1 播娘蒿总 RNA的提取 | 第31页 |
| 3．2 多个物种 CBF蛋白氨基酸序列同源性比对结果 | 第31-32页 |
| 3．3 播娘蒿 CBF基因 EST的克隆结果 | 第32-34页 |
| 3．4 播娘蒿 CBF基因3’RACE结果及巢式引物验证 | 第34页 |
| 4 讨论 | 第34-39页 |
| 4．1 播娘蒿 CBF基因 EST序列克隆 | 第34-36页 |
| 4．1．1 播娘蒿总 RNA提取注意事项 | 第34-35页 |
| 4．1．2 播娘蒿 CBF基因同源克隆中简并 PCR技术的应用 | 第35-36页 |
| 4．2 cDNA3’末端快速扩增(3’RACE)的使用 | 第36-39页 |
| 第三章 播娘蒿 CBF基因5’末端扩增 | 第39-50页 |
| 1 试验材料 | 第39页 |
| 1．1 模板 | 第39页 |
| 1．2 引物设计与合成 | 第39页 |
| 2 试验方法 | 第39-43页 |
| 2．1 环化法 | 第39-41页 |
| 2．2 末端脱氧核糖核酸转移酶法 | 第41-42页 |
| 2．3 CLONTECH的5’RACE反转录酶法 | 第42-43页 |
| 3 结果与分析 | 第43-44页 |
| 3．1 环化法5’RACD | 第43页 |
| 3．2 末端脱氧核糖核酸转移酶(TDT酶)法5’RACE | 第43-44页 |
| 3．3 CLONTECH的5’RACE反转录酶法 | 第44页 |
| 4 讨论 | 第44-50页 |
| 4．1 5’RACE方法的比较 | 第44-46页 |
| 4．2 5’RACE技术的优化改进 | 第46-50页 |
| 第四章 播娘蒿 CBF基因序列结构分析和功能预测 | 第50-64页 |
| 1 分析方法 | 第50-52页 |
| 1．1 核苷酸序列分析 | 第50-51页 |
| 1．1．1 核酸 GC含量分布 | 第50页 |
| 1．1．2 序列读框分析 | 第50页 |
| 1．1．3 加 A信号位点预测 | 第50页 |
| 1．1．4 相似性搜索 | 第50-51页 |
| 1．2 蛋白质序列分析 | 第51-52页 |
| 1．2．1 蛋白质性质分析 | 第51页 |
| 1．2．2 相似性搜索 | 第51页 |
| 1．2．3 BLOCKs分析和功能结构域确定 | 第51页 |
| 1．2．4 疏水性分析 | 第51页 |
| 1．2．5 核定位信号分析 | 第51页 |
| 1．2．6 信号肽预测 | 第51页 |
| 1．2．7 卷曲螺旋预测 | 第51-52页 |
| 1．2．8 跨膜结构预测 | 第52页 |
| 1．2．9 二级结构预测 | 第52页 |
| 1．2．10 三级结构预测 | 第52页 |
| 1．2．11 蛋白质家族分析 | 第52页 |
| 1．2．12 系统发育分析 | 第52页 |
| 2 结果分析 | 第52-62页 |
| 2．1 核酸序列分析结果 | 第52-55页 |
| 2．1．1 核酸 GC含量分析结果 | 第52-53页 |
| 2．1．2 序列读框分析分析结果 | 第53页 |
| 2．1．3 加 A信号位点预测结果 | 第53-54页 |
| 2．1．4 相似性搜索结果 | 第54-55页 |
| 2．2 蛋白质序列分析 | 第55-62页 |
| 2．2．1 蛋白质性质分析 | 第55页 |
| 2．2．2 相似性搜索结果分析 | 第55页 |
| 2．2．3 BLOCKs分析和功能结构域确定分析 | 第55-56页 |
| 2．2．4 疏水性分析结果 | 第56-57页 |
| 2．2．5 核定位信号预测 | 第57页 |
| 2．2．6 信号肽预测 | 第57页 |
| 2．2．7 卷曲螺旋预测结果 | 第57-58页 |
| 2．2．8 跨膜结构预测结果 | 第58-59页 |
| 2．2．9 二级结构预测结果 | 第59-60页 |
| 2．2．10 三级结构预测结果 | 第60-61页 |
| 2．2．11 蛋白质家族分析结果 | 第61页 |
| 2．2．12 系统发育分析 | 第61-62页 |
| 3 讨论 | 第62-64页 |
| 3．1 生物信息学分析方法的产生和利用 | 第62页 |
| 3．2 播娘蒿 CBF基因的结构和功能预测 | 第62-63页 |
| 3．3 播娘蒿 CBF基因与拟南芥 CBF基因的不同 | 第63页 |
| 3．4 播娘蒿 CBF基因5’端非翻译区在抗寒能力中可能存在的作用 | 第63-64页 |
| 第五章 播娘蒿 CBF基因的原核表达和纯化 | 第64-74页 |
| 1． 材料 | 第64-65页 |
| 1．1 质粒和菌株 | 第64页 |
| 1．2 酶和主要试剂 | 第64-65页 |
| 1．3 引物合成 | 第65页 |
| 2． 方法 | 第65-69页 |
| 2．1 播娘蒿 CBF基因完整 ORF框的引物设计 | 第65页 |
| 2．2 播娘蒿 CBF基因完整 ORF框的 PCR扩增 | 第65-66页 |
| 2．3 重组表达载体的构建 | 第66页 |
| 2．4 pET32a-CBF在大肠杆菌中的表达筛选 | 第66页 |
| 2．5 重组菌菌体裂解物的凝胶电泳 | 第66-68页 |
| 2．5．1 样品制备 | 第66-67页 |
| 2．5．2 SDS聚丙烯酰胺凝胶 | 第67-68页 |
| 2．5．3 考马斯亮蓝对 SDS聚丙烯酰胺凝胶染色 | 第68页 |
| 2．6 播娘蒿 CBF蛋白的分离纯化 | 第68-69页 |
| 2．6．1 超声波破碎细胞 | 第68页 |
| 2．6．2 通过金属螯合亲和层析纯化播娘蒿 CBF蛋白 | 第68-69页 |
| 3． 结果和分析 | 第69-71页 |
| 3．1 播娘蒿 CBF目的基因片段的扩增和表达载体的构建 | 第69页 |
| 3．2 重组载体pET32a-CBF的表达和 SDS-PAGE电泳 | 第69-70页 |
| 3．3 原核表达播娘蒿 CBF融合蛋白的分离纯化 | 第70-71页 |
| 4． 讨论 | 第71-74页 |
| 4．1 播娘蒿 CBF蛋白表达诱导时间和 IPTG浓度的优化 | 第71-72页 |
| 4．2 pET表达载体的选择与播娘蒿CBF蛋白的展望 | 第72-74页 |
| 结论 | 第74-75页 |
| 致谢 | 第75-76页 |
| 综述一 植物抗寒研究进展 | 第76-86页 |
| 1 植物的低温损害机理 | 第76-79页 |
| 1．1 生物膜系统 | 第76-78页 |
| 1．1．1 膜蛋白的变化 | 第77-78页 |
| 1．1．2 膜脂的变化 | 第78页 |
| 1．2 酶系统与植物抗寒性 | 第78-79页 |
| 2 植物低温胁迫下的生理响应及低温诱导基因的研究方法 | 第79-81页 |
| 2．1 低温胁迫下植物生理响应的研究方法 | 第79-80页 |
| 2．2 低温诱导基因表达的研究方法 | 第80-81页 |
| 2．2．1 同工酶标记 | 第80页 |
| 2．2．2 蛋白质标记 | 第80页 |
| 2．2．3 DNA分子标记 | 第80-81页 |
| 2．2．4 DNA测序仪和基因数据库的应用 | 第81页 |
| 3 冷驯化对植物抗寒性的生理影响 | 第81-83页 |
| 3．1 冷驯化提高了膜的抗冷性 | 第81页 |
| 3．2 冷驯化提高了植物的抗执化能力 | 第81-82页 |
| 3．3 冷驯化提高了细胞内可溶物的积累 | 第82页 |
| 3．4 冷驯化提高植物低温诱导基因表达及其产物积累 | 第82-83页 |
| 4 目前已知的提高植物抗寒性的措施 | 第83-85页 |
| 4．1 低温驯化 | 第83页 |
| 4．2 Ca和 CaM | 第83页 |
| 4．3 化学物质 | 第83-84页 |
| 4．4 转入与膜稳定性和流动性相关的基因 | 第84页 |
| 4．5 转入与细胞活性相关的蛋白基因 | 第84页 |
| 4．6 转入与抗渗透胁迫相关的基因 | 第84页 |
| 4．7 转入抗冻蛋白基因 | 第84页 |
| 4．8 清除活性氧中间产物 | 第84-85页 |
| 5 问题与前景展望 | 第85-86页 |
| 综述二 CBF基因研究进展 | 第86-95页 |
| 1 CBF基因的发现 | 第86-87页 |
| 2 CBF转录激活因子的结构与特性 | 第87-89页 |
| 3 CBF转录激活因子的表达 | 第89-90页 |
| 4 CBF转录激活因子的生理生化功能 | 第90-91页 |
| 5 CBF转录激活因子在提高植物耐逆性中的作用 | 第91-92页 |
| 6 CBF的同源性基因 | 第92-93页 |
| 7 展望 | 第93-95页 |
| 参考文献 | 第95-101页 |
| 在校期间学习情况 | 第101-102页 |
| 声明 | 第102页 |
