| 第一部分 岩豆凝集素的化学修饰与光谱分析 | 第1-34页 |
| 一、摘要 | 第11-12页 |
| 二、Abstract | 第12-14页 |
| 三、论文内容 | 第14-34页 |
| 1 引言 | 第14-17页 |
| 2 材料、试剂和方法 | 第17-21页 |
| ·材料 | 第17-18页 |
| ·实验方法 | 第18-21页 |
| ·蛋白质浓度的测定 | 第18页 |
| ·MDL分子中色氨酸残基的修饰及被修饰Trp残基数的测定 | 第18页 |
| ·糖链的氧化 | 第18-19页 |
| ·组氨酸残基的修饰 | 第19页 |
| ·羧基组氨基酸残基的修饰 | 第19页 |
| ·精氨酸残基的修饰 | 第19页 |
| ·凝血活性的测定 | 第19-20页 |
| ·内源荧光光谱测定 | 第20页 |
| ·圆二色谱的测定 | 第20页 |
| ·荧光淬灭研究 | 第20-21页 |
| ·KI对MDL荧光的淬灭作用 | 第20页 |
| ·丙烯酰胺对MDL荧光的淬灭作用 | 第20-21页 |
| ·碘乙酸对MDL荧光的淬灭作用 | 第21页 |
| 3 结果与讨论 | 第21-29页 |
| ·岩豆凝集素的化学修饰对凝血活性的影响 | 第21-23页 |
| ·岩豆凝集素的化学修饰对荧光光谱的影响 | 第23-25页 |
| ·岩豆凝集素的化学修饰对圆二色谱的影响 | 第25-26页 |
| ·MDL的荧光淬灭 | 第26-29页 |
| ·KI的淬灭作用 | 第26页 |
| ·丙烯酰胺的淬灭作用 | 第26-28页 |
| ·碘乙酸的荧光淬灭作用 | 第28-29页 |
| 4 结论 | 第29-30页 |
| 5 参考文献 | 第30-34页 |
| 第二部分 风雨花甘露糖结合凝集素基因的生物信息学分析 | 第34-70页 |
| 一、摘要 | 第34-36页 |
| 二、Abstract | 第36-38页 |
| 三、论文内容 | 第38-70页 |
| 1 前言 | 第38-40页 |
| 2 材料 | 第40页 |
| 3 方法 | 第40-41页 |
| 4 结果与分析 | 第41-64页 |
| ·ZGA基因全长核苷酸序列及其分析 | 第41-42页 |
| ·ZGA推测的氨基酸序列及其分析 | 第42-52页 |
| ·ZGA推导出的氨基酸序列 | 第42-43页 |
| ·风雨花凝集素(ZGA)推测的氨基酸序列的同源性分析 | 第43-44页 |
| ·ZGA推测的氨基酸序列的分析 | 第44-46页 |
| ·ZGA前体蛋白的跨膜区预测 | 第44页 |
| ·ZGA前体蛋白的信号肽分析 | 第44-46页 |
| ·ZGA成熟蛋白序列分析 | 第46-50页 |
| ·ZGA成熟蛋白序列的确定 | 第46-47页 |
| ·ZGA成熟蛋白序列的物理特定参数分析 | 第47-48页 |
| ·ZGA成熟蛋白的修饰位点的预测分析 | 第48-49页 |
| ·ZGA成熟蛋白序列同源性 | 第49-50页 |
| ·根据同源序列构建的进化树分析 | 第50-52页 |
| ·ZGA成熟蛋白的二级结构预测 | 第52-53页 |
| ·疏水簇分析 | 第53-54页 |
| ·ZGA成熟蛋白的三维结构预测 | 第54-56页 |
| ·ZGA成熟蛋白序列中结构域的预测分析 | 第56-59页 |
| ·ZGA成熟蛋白的抗原决定簇分析 | 第59-62页 |
| ·ZGA基因与大肠杆菌密码子使用频率的比较 | 第62-64页 |
| 5 讨论 | 第64-65页 |
| 6 小结 | 第65-66页 |
| 7 参考文献 | 第66-70页 |
| 第三部分 风雨花甘露糖结合凝集素基因在大肠杆菌中的表达与纯化 | 第70-137页 |
| 一、摘要 | 第70-72页 |
| 二、Abstract | 第72-75页 |
| 三、论文内容 | 第75-137页 |
| 1 引言 | 第75-78页 |
| 2.实验材料与试剂 | 第78-82页 |
| ·材料、菌株及质粒载体 | 第78-79页 |
| ·主要分子生物学试剂和试剂盒 | 第79页 |
| ·主要试剂 | 第79-81页 |
| ·主要仪器设备 | 第81-82页 |
| 3.实验方法 | 第82-97页 |
| ·、风雨花地下球茎总RNA的提取 | 第82-83页 |
| ·cDNA的合成 | 第83页 |
| ·Z1、Z2和Z3三个目的基因片段的获得 | 第83-84页 |
| ·Z1、Z2和Z3 PCR产物的亚克隆 | 第84-86页 |
| ·Z1、Z2和Z3 PCR产物与pMD-18T Vector连接 | 第84页 |
| ·连接产物转化克隆宿主菌(E.coli Top-10) | 第84-85页 |
| ·pMD-18T-Z1，pMD-18T-Z2和pMD-18T-Z3重组克隆质粒的鉴定 | 第85-86页 |
| ·菌落PCR鉴定 | 第85页 |
| ·重组质粒DNA的小量制备及重组质粒的双酶切鉴定 | 第85-86页 |
| ·重组质粒DNA的小量制备 | 第85-86页 |
| ·pMD-18T-Z1，pMD-18T-Z2和pMD-18T-Z3的双酶切鉴定 | 第86页 |
| ·重组克隆质粒pMD-18T-Z1，pMD-18T-Z2和pMD-18T-Z3的测序 | 第86页 |
| ·表达载体pET32c(+)的制备及双酶切 | 第86-87页 |
| ·表达载体pET32c(+)的制备 | 第86-87页 |
| ·表达载体pET32c(+)的双酶切 | 第87页 |
| ·表达载体pET32c(+)和Z1、Z2、和Z3目的基因片段的连接 | 第87页 |
| ·重组表达质粒pET32c-Z1，pET32c-Z2和pET32c-Z3的转化克隆宿主菌 | 第87页 |
| ·重组表达质粒pET32c-Z1，pET32c-Z2和pET32c-Z3阳性克隆的鉴定 | 第87-89页 |
| ·重组表达质粒pET32c-Z1，pET32c-Z2和pET32c-Z3转化表达宿主菌(BL21/DE3) | 第89页 |
| ·pET32c-Z1，pET32c-Z2和pET32c-Z3重组工程菌的诱导表达 | 第89页 |
| ·菌种的保存 | 第89页 |
| ·细胞光密度测定 | 第89页 |
| ·蛋白质表达量的测定 | 第89页 |
| ·pET32c-Z1，pET32c-Z2和pET32c-Z3工程菌诱导表达条件的优化 | 第89-93页 |
| ·培养基pH值对细菌生长及表达的影响 | 第90页 |
| ·温度对细菌生长及蛋白质表达的影响 | 第90页 |
| ·装液量对细菌生长及蛋白质表达的影响 | 第90页 |
| ·IPTG对细菌生长及蛋白质表达的影响 | 第90-91页 |
| ·接种量对细菌生长及蛋白质表达的影响 | 第91页 |
| ·补充碳源形式对细菌生长及蛋白质表达的影响 | 第91页 |
| ·诱导时机对细菌生长及蛋白质表达的影响 | 第91页 |
| ·无机离子对细菌生长及蛋白质表达的影响 | 第91-92页 |
| ·Ca~(2+)离子的影响 | 第91-92页 |
| ·Mg~(2+)离子的影响 | 第92页 |
| ·NH_4~+离子的影响 | 第92页 |
| ·诱导时间对细菌生长及蛋白质表达的影响 | 第92页 |
| ·pET32c-Z1，pET32c-Z2和pET32c-Z3重组工程菌表达条件的优化 | 第92-93页 |
| ·pET32c-Z1，pET32c-Z2和pET32c-Z3工程菌扩大诱导表达(3L) | 第93页 |
| ·Z1、Z2和Z3重组目的蛋白的分离纯化 | 第93-95页 |
| ·pET32c-Z1，pET32c-Z2和pET32c-Z3工程菌的破菌 | 第93页 |
| ·Z1、Z2和Z3重组目的蛋白包涵体的分离与溶解 | 第93-94页 |
| ·Z1、Z2和Z3重组目的蛋白分离纯化 | 第94-95页 |
| ·亲和层析 | 第94页 |
| ·融合蛋白的酶切 | 第94页 |
| ·阴离子交换层析 | 第94页 |
| ·阳离子交换层析 | 第94-95页 |
| ·纯化的Z1、Z2和Z3重组目的蛋白的纯度检测 | 第95页 |
| ·纯化的Z1、Z2和Z3重组目的蛋白凝血活性及稳定性的测定 | 第95-96页 |
| ·纯化的Z1、Z2和Z3重组目的蛋白的等电点检测 | 第96页 |
| ·抗体的制备、纯化与检测 | 第96-97页 |
| ·抗体的制备与纯化 | 第96-97页 |
| ·纯化的Z1、Z2和Z3重组目的蛋白的免疫学检测 | 第97页 |
| 4.结果与分析 | 第97-122页 |
| ·风雨花地下球茎总RNA的提取 | 第97-98页 |
| ·Z1、Z2和Z3目的基因片断的获得 | 第98页 |
| ·Z1、Z2和Z3 PCR产物与pMD18-T Vector的连接 | 第98页 |
| ·pMD-18T-Z1,pMD-18T-Z2和pMD-18T-Z3阳性克隆的筛选 | 第98-100页 |
| ·pMD-18T-Z1，pMD-18T-Z2和pMD-18T-Z3重组子的PCR鉴定 | 第98-99页 |
| ·pMD-18T-Z1，pMD-18T-Z2和pMD-18T-Z3重组子的双酶切鉴定 | 第99-100页 |
| ·pMD-18T-Z1，pMD-18T-Z2和pMD-18T-Z3重组子的测序 | 第100页 |
| ·Z1、Z2和Z3目的基因片断与表达质粒pET32c(+)的连接转化 | 第100-101页 |
| ·pET32c-Z1，pET32c-Z2和pET32c-Z3阳性克隆的筛选 | 第101页 |
| ·pET32c-Z1，pET32c-Z2和pET32c-Z3重组子的PCR鉴定 | 第101页 |
| ·pET32c-Z1，pET32c-Z2和pET32c-Z3重组子的双酶切鉴定 | 第101页 |
| ·重组质粒pET32c-Z1，pET32c-Z2和pET32c-Z3转化表达宿主菌(BL21/DE3) | 第101-102页 |
| ·pET32c-Z1，pET32c-Z2和pET32c-Z3工程菌的小量诱导表达 | 第102-103页 |
| ·pET32c-Z1，pET32c-Z2和pET32c-Z3工程菌表达条件的优化 | 第103-115页 |
| ·培养基pH值对细菌生长及表达的影响 | 第103-104页 |
| ·温度对细菌生长及表达的影响 | 第104-105页 |
| ·装液量对细菌生长及表达的影响 | 第105-107页 |
| ·IPTG对细菌生长及表达的影响 | 第107-108页 |
| ·接种量对细菌生长及表达的影响 | 第108页 |
| ·补充碳源形式对细菌生长及表达的影响 | 第108-110页 |
| ·诱导时机对细菌生长及表达的影响 | 第110-111页 |
| ·无机离子对细菌生长及表达的影响 | 第111-113页 |
| ·Ca~(2+)离子的影响 | 第111-112页 |
| ·Mg~(2+)离子的影响 | 第112-113页 |
| ·NH_4~+离子的影响 | 第113页 |
| ·诱导时间对细菌生长及表达的影响 | 第113-114页 |
| ·表达条件的优化结果 | 第114-115页 |
| ·pET32c-Z1、pET32c-Z2和pET32c-Z3工程菌扩大诱导结果 | 第115-116页 |
| ·pET32c-Z1、pET32c-Z2和pET32c-Z3宿主菌的破菌及包涵体的溶解 | 第116-117页 |
| ·Z1、Z2和Z3重组目的蛋白的分离纯化 | 第117-120页 |
| ·Z1重组目的蛋白的分离纯化 | 第117-118页 |
| ·Z2重组目的蛋白的分离纯化 | 第118页 |
| ·Z3重组目的蛋白的分离纯化 | 第118-119页 |
| ·纯化的Z1、Z2和Z3重组目的蛋白纯度检测 | 第119-120页 |
| ·纯化的Z1、Z2和Z3重组目的蛋白凝血活性检测 | 第120-121页 |
| ·纯化的Z1和Z2重组目的蛋白稳定性测定 | 第121页 |
| ·温度对纯化的Z1和Z2重组目的蛋白的影响 | 第121页 |
| ·pH对纯化的Z1和Z2重组目的蛋白的影响 | 第121页 |
| ·纯化的Z1、Z2和Z3重组目的蛋白等电点检测 | 第121-122页 |
| ·纯化的Z1、Z2和Z3重组目的蛋白的Western Blot检测 | 第122页 |
| 5.讨论 | 第122-129页 |
| ·蛋白质表达系统和表达载体的选择 | 第122-123页 |
| ·表达条件的优化与选择 | 第123-125页 |
| ·包涵体的纯化与复性 | 第125-126页 |
| ·蛋白纯化方法的选择 | 第126-128页 |
| ·纯化蛋白的活性及稳定性检测 | 第128-129页 |
| 6 小结 | 第129-130页 |
| 7 参考文献 | 第130-137页 |
| 文献综述 包涵体的形成和体外复性 | 第137-197页 |
| 1 引言 | 第137页 |
| 2 原核细胞中蛋白质聚集-包涵体的形成 | 第137-164页 |
| ·蛋白质倾向聚集的结构特征 | 第138-140页 |
| ·二硫键 | 第138-139页 |
| ·膜蛋白 | 第139-140页 |
| ·糖基化 | 第140页 |
| ·包涵体组成和结构以及包涵体形成的动力学 | 第140-145页 |
| ·构造和结构 | 第141-142页 |
| ·包涵体的组成 | 第142-143页 |
| ·蛋白质体内聚集的动力学 | 第143-145页 |
| ·包涵体的稳定性 | 第145页 |
| ·包涵体形成的生理学 | 第145-157页 |
| ·包涵体合成的新陈代谢负担 | 第145-149页 |
| ·错误折叠蛋白的响应 | 第149-156页 |
| ·压力反应 | 第150-152页 |
| ·分子伴侣的作用 | 第152-155页 |
| ·错误折叠蛋白的细胞周质反应 | 第155页 |
| ·错误折叠蛋白在其他生物体中的响应 | 第155-156页 |
| ·高质量包涵体的宿主特征 | 第156-157页 |
| ·基于包涵体的相对可溶产物 | 第157-164页 |
| ·培养条件促进聚集 | 第157页 |
| ·包涵体是二硫键不能正确形成的结果 | 第157-158页 |
| ·如何避免包涵体的形成和促使蛋白质的正确折叠 | 第158-164页 |
| ·蛋白质的合成速率 | 第159页 |
| ·融合蛋白 | 第159-161页 |
| ·伴侣蛋白和折叠酶的共表达 | 第161-162页 |
| ·培养条件的优化及折叠促进剂的添加 | 第162-163页 |
| ·细胞内的氧化还原电势 | 第163-164页 |
| ·其他原核细胞的包涵体 | 第164页 |
| 3 包涵体产物的体外复性 | 第164-181页 |
| ·包涵体的制备 | 第165-167页 |
| ·包涵体的分离 | 第165-166页 |
| ·包涵体的纯化 | 第166页 |
| ·包涵体的溶解 | 第166-167页 |
| ·包涵体蛋白的复性 | 第167-181页 |
| ·包涵体蛋白复性机制研究 | 第168页 |
| ·包涵体蛋白的复性方法 | 第168-175页 |
| ·、液相复性 | 第169-170页 |
| ·稀释复性 | 第169-170页 |
| ·透析复性 | 第170页 |
| ·超滤复性 | 第170页 |
| ·固相复性 | 第170-174页 |
| ·凝胶过滤 | 第171-172页 |
| ·吸附层析 | 第172-174页 |
| ·高压复性 | 第174-175页 |
| ·其他复性方法 | 第175页 |
| ·二硫键形成方法 | 第175-176页 |
| ·影响复性的因素 | 第176-177页 |
| ·蛋白浓度 | 第176-177页 |
| ·温度和pH | 第177页 |
| ·稀释倍数 | 第177页 |
| ·离子强度 | 第177页 |
| ·复性时的辅助因子 | 第177-180页 |
| ·复性蛋白质的检测 | 第180-181页 |
| 4 参考文献 | 第181-197页 |
| 研究生期间参加课题与发表论文情况 | 第197-199页 |
| 致谢 | 第199-200页 |
| 声明 | 第200页 |
