| 摘要 | 第1-4页 |
| Abstract | 第4-10页 |
| 引言 | 第10-13页 |
| 第一部分 建立分别表达GM-CSF和IL-4的EA.hy926重组细胞系 | 第13-36页 |
| 第一部分 第一章 实验材料 | 第14-17页 |
| ·载体和质粒 | 第14页 |
| ·细胞株 | 第14页 |
| ·试剂 | 第14-15页 |
| ·引物 | 第15页 |
| ·仪器 | 第15-16页 |
| ·细胞培养基的配置 | 第16页 |
| ·常用软件及数据库 | 第16-17页 |
| 第一部分 第二章 实验方法 | 第17-31页 |
| ·目的基因IL-4的获得 | 第17-19页 |
| ·PCR扩增IL-4基因 | 第17页 |
| ·DNA纯化试剂盒纯化PCR产物 | 第17-18页 |
| ·纯化产物估量 | 第18页 |
| ·纯化产物IL-4与Peasy-T1载体连接 | 第18页 |
| ·转化感受态细胞 | 第18-19页 |
| ·GM-CSF基因的获得 | 第19-20页 |
| ·PCR扩增GM-CSF基因 | 第19页 |
| ·DNA纯化试剂盒纯化PCR产物 | 第19页 |
| ·纯化产物估量 | 第19页 |
| ·纯化产物GM-CSF与pEASY-T1载体连接 | 第19-20页 |
| ·转化感受态细胞 | 第20页 |
| ·目的基因IL-4连入pBPLV绒体 | 第20-22页 |
| ·载体和片段双酶切反应 | 第20-21页 |
| ·片段与载体酶切后纯化 | 第21页 |
| ·纯化产物IL-4与pBPLV载体连接 | 第21页 |
| ·连接产物转化 | 第21-22页 |
| ·目的基因GM-CSF连入pBPLV载体 | 第22-24页 |
| ·载体和片段双酶切 | 第22页 |
| ·片段与载体酶切后纯化 | 第22-23页 |
| ·纯化产物GM-CSF与pBPLV载体连接 | 第23页 |
| ·连接产物转化 | 第23-24页 |
| ·阳性克隆的筛选 | 第24页 |
| ·阳性克隆的鉴定 | 第24-26页 |
| ·质粒提取 | 第24-25页 |
| ·双酶切鉴定 | 第25-26页 |
| ·质粒大量提取 | 第26-27页 |
| ·细胞培养 | 第27-28页 |
| ·细胞复苏 | 第27-28页 |
| ·细胞传代培养 | 第28页 |
| ·细胞冻存 | 第28页 |
| ·慢病毒的包装 | 第28-29页 |
| ·293T细胞的培养 | 第28页 |
| ·慢病毒包装 | 第28-29页 |
| ·慢病毒感染EA.hy 926细胞 | 第29-31页 |
| 第一部分 第三章 实验结果 | 第31-35页 |
| ·获得目的基因IL-4和GM-CSF | 第31页 |
| ·重组质粒构建 | 第31-34页 |
| ·菌落PCR | 第31-32页 |
| ·重组质粒双酶切鉴定 | 第32-33页 |
| ·基因测序结果 | 第33-34页 |
| ·慢病毒包装结果 | 第34页 |
| ·慢病毒感染结果 | 第34-35页 |
| 第一部分 第四章 实验结论 | 第35-36页 |
| 第二部分 重组细胞的细胞性质确定 | 第36-50页 |
| 第二部分 第一章 实验材料 | 第36-40页 |
| ·实验试剂 | 第36-37页 |
| ·实验仪器 | 第37页 |
| ·Western blot主要溶液配制方法 | 第37-40页 |
| 第二部分 第二章 实验方法 | 第40-45页 |
| ·重组细胞的生长趋势 | 第40页 |
| ·RT-PCR检测重组细胞目的基因的表达 | 第40-41页 |
| ·提取总RNA | 第40页 |
| ·RT-PCR反应 | 第40-41页 |
| ·Western blot测定感染后细胞蛋白水平的表达 | 第41-43页 |
| ·细胞培养液超滤浓缩制备样品 | 第41页 |
| ·BCA定量 | 第41-42页 |
| ·蛋白质聚丙烯凝胶电泳 | 第42页 |
| ·蛋白质印迹 | 第42-43页 |
| ·免疫反应 | 第43页 |
| ·酶联免疫吸附试剂盒测定细胞的分泌量 | 第43-44页 |
| ·制备饲养层细胞 | 第44-45页 |
| 第二部分 第三章 实验结果 | 第45-49页 |
| ·重组细胞生长曲线的测定 | 第45页 |
| ·RT-PCR方法检测在基因水平的表达 | 第45-46页 |
| ·Western blot结果 | 第46-47页 |
| ·酶联免疫吸附结果 | 第47-48页 |
| ·制备饲养层细胞 | 第48-49页 |
| 第二部分 第四章 实验结论 | 第49-50页 |
| 第三部分 讨论 | 第50-52页 |
| 参考文献 | 第52-55页 |
| 综述 | 第55-62页 |
| 参考文献 | 第58-62页 |
| 攻读学位期间的研究成果 | 第62-63页 |
| 致谢 | 第63-64页 |