| 摘 要 | 第1-5页 |
| ABSTRACT | 第5-8页 |
| 目 录 | 第8-15页 |
| 第一章 文 献 综 述 | 第15-49页 |
| ·引言 | 第15-18页 |
| ·头孢菌素类药物 | 第15页 |
| ·头孢菌素的结构 | 第15-16页 |
| ·头孢菌素的作用机理及病菌耐药机理 | 第16页 |
| ·头孢菌素的市场状况 | 第16-17页 |
| ·头孢菌素的原料情况 | 第17-18页 |
| ·7-ACA概述 | 第18-21页 |
| ·7-ACA的生产方法 | 第18-20页 |
| ·化学法 | 第18-19页 |
| ·酶法 | 第19-20页 |
| ·7-ACA的生产状况 | 第20-21页 |
| ·D-氨基酸氧化酶 | 第21-25页 |
| ·DAAO的催化机理 | 第21-22页 |
| ·DAAO的来源和性质 | 第22页 |
| ·DAAO基因结构的分析 | 第22-23页 |
| ·DAAO的表达和纯化 | 第23-24页 |
| ·DAAO蛋白空间结构 | 第24-25页 |
| ·GL-7-ACA酰化酶 | 第25-30页 |
| ·产GL-7-ACA 酰化酶菌株的筛选 | 第25-26页 |
| ·GL-7-ACA 酰化酶分类及性质 | 第26-28页 |
| ·GL-7-ACA酰化酶的表达和纯化 | 第28-29页 |
| ·GL-7-ACA酰化酶蛋白空间结构 | 第29-30页 |
| ·7-ACA的催化工艺 | 第30-34页 |
| ·酶活稳定性 | 第30-31页 |
| ·酶的固定化 | 第31-32页 |
| ·反应器 | 第32页 |
| ·酶法生产7-ACA举例 | 第32-33页 |
| ·酶法生产7-ACA存在的主要问题及发展方向 | 第33-34页 |
| ·目的基因的克隆方法 | 第34-38页 |
| ·构建基因文库 | 第34-35页 |
| ·化学合成 | 第35-36页 |
| ·土壤中获取 | 第36-38页 |
| ·土壤DNA的提取 | 第36-37页 |
| ·土壤DNA的纯化 | 第37页 |
| ·土壤DNA的PCR扩增 | 第37-38页 |
| ·基因克隆和表达系统 | 第38-44页 |
| ·大肠杆菌表达系统 | 第38-41页 |
| ·大肠杆菌表达载体的构成 | 第38页 |
| ·大肠杆菌表达系统分类 | 第38-40页 |
| ·重组大肠杆菌的高密度培养 | 第40-41页 |
| ·巴斯德毕赤酵母表达系统 | 第41-44页 |
| ·概述 | 第41页 |
| ·Pichia pastoris表达载体特点及构建 | 第41-42页 |
| ·表达载体的整合方式 | 第42页 |
| ·外源基因的分泌表达 | 第42-43页 |
| ·影响外源基因表达的因素 | 第43-44页 |
| ·融合蛋白的研究进展 | 第44-45页 |
| ·论文的意义和目的 | 第45-49页 |
| ·本论文的研究思路 | 第45-47页 |
| ·主要研究内容 | 第47页 |
| ·主要创新思路 | 第47-49页 |
| 第二章 D-氨基酸氧化酶的克隆与表达 | 第49-75页 |
| ·引言 | 第49-50页 |
| ·材料与方法 | 第50-58页 |
| ·质粒与菌株 | 第50页 |
| ·工具酶与试剂 | 第50-51页 |
| ·PCR引物 | 第51页 |
| ·实验方法 | 第51-58页 |
| ·三角酵母DAAO基因的克隆 | 第58-66页 |
| ·三角酵母DAAO基因的扩增 | 第58-59页 |
| ·三角酵母DAAO基因的重组质粒的构建 | 第59-60页 |
| ·三角酵母DAAO基因的分析 | 第60-62页 |
| ·三角酵母DAAO基因在大肠杆菌中的表达 | 第62页 |
| ·三角酵母DAAO重组菌催化头孢菌素C | 第62-64页 |
| ·I344对DAAO酶活的影响 | 第64-65页 |
| ·DAAO的催化常数Km | 第65-66页 |
| ·重组大肠杆菌的诱导表达 | 第66-72页 |
| ·最佳诱导菌龄的确定 | 第66-67页 |
| ·诱导剂IPTG浓度对酶活的影响 | 第67页 |
| ·诱导温度对DAAO酶活表达的影响 | 第67-68页 |
| ·乳糖诱导的初步研究 | 第68-69页 |
| ·溶氧对DAAO酶活的影响 | 第69页 |
| ·辅酶FAD对DAAO酶活的影响 | 第69-70页 |
| ·D-丙氨酸对DAAO表达的影响 | 第70页 |
| ·补料分批培养表达DAAO | 第70-72页 |
| ·DAAO重组毕赤酵母的构建及诱导表达 | 第72-73页 |
| ·本章小结 | 第73-75页 |
| 第三章 GL-7-ACA酰化酶基因的扩增及其克隆和表达 | 第75-120页 |
| ·引言 | 第75-76页 |
| ·材料和方法 | 第76-85页 |
| ·质粒与菌株 | 第76-77页 |
| ·工具酶与试剂 | 第77页 |
| ·PCR引物 | 第77页 |
| ·土壤微生物筛选用培养基 | 第77-78页 |
| ·实验方法 | 第78-85页 |
| ·土壤中GL-7-ACA酰化酶菌株的筛选 | 第85-86页 |
| ·土壤中GL-7-ACA酰化酶基因快速获取的新思路 | 第86-91页 |
| ·新思路的提出 | 第86页 |
| ·土壤DNA的直接提取 | 第86-87页 |
| ·土壤DNA为模板进行PCR扩增 | 第87-88页 |
| ·土壤微生物的选择性培养 | 第88-90页 |
| ·GL-7-ACA酰化酶基因的PCR扩增 | 第90-91页 |
| ·GL-7-ACA酰化酶基因的分析 | 第91-94页 |
| ·GL-7-ACA酰化酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达 | 第94-99页 |
| ·用于表达质粒克隆的GL-7-ACA酰化酶基因的PCR扩增 | 第94-95页 |
| ·GL-7-ACA酰化酶基因重组表达质粒的构建 | 第95-96页 |
| ·GL-7-ACA酰化酶基因重组表达质粒的筛选验证 | 第96-99页 |
| ·GL-7-ACA酰化酶表达条件的优化 | 第99-106页 |
| ·最佳诱导菌龄的确定 | 第99页 |
| ·诱导剂IPTG浓度对酶活的影响 | 第99-100页 |
| ·诱导温度对GL-7-ACA酰化酶表达的影响 | 第100-101页 |
| ·乳糖诱导GL-7-ACA酰化酶表达的研究 | 第101-102页 |
| ·不同培养基培养诱导的初步尝试 | 第102-103页 |
| ·重组大肠杆菌上罐培养 | 第103-106页 |
| ·细胞破碎及酶的分离纯化 | 第106-110页 |
| ·重组大肠杆菌的破碎 | 第106-108页 |
| ·GL-7-ACA酰化酶的纯化和表达蛋白的形态分析 | 第108-109页 |
| ·GL-7-ACA酰化酶催化反应的表观米氏常数Km | 第109-110页 |
| ·GL-7-ACA酰化酶基因在毕赤酵母中的克隆和表达 | 第110-117页 |
| ·重组毕赤酵母质粒的构建 | 第110-111页 |
| ·Pichia pastoris的转化与筛选 | 第111-112页 |
| ·重组Pichia pastoris的诱导和表达 | 第112-114页 |
| ·重组Pichia pastoris破碎方法的研究 | 第114-117页 |
| ·本章小结 | 第117-120页 |
| 第四章 双酶基因的克隆和共表达 | 第120-130页 |
| ·引言 | 第120页 |
| ·材料和方法 | 第120-125页 |
| ·质粒与菌株 | 第120页 |
| ·工具酶与试剂 | 第120-121页 |
| ·实验方法 | 第121-125页 |
| ·双酶基因共表达的重组大肠杆菌的构建 | 第125-127页 |
| ·双酶基因共表达的重组质粒的构建 | 第125页 |
| ·双酶基因共表达的重组大肠杆菌的表达 | 第125-126页 |
| ·双酶基因共表达重组大肠杆菌催化头孢菌素C | 第126-127页 |
| ·双酶基因共表达的重组大肠杆菌的上罐培养 | 第127-129页 |
| ·本章小结 | 第129-130页 |
| 第五章 融合蛋白基因的构建、表达及用于头孢C的催化 | 第130-162页 |
| ·引言 | 第130-131页 |
| ·材料和方法 | 第131-135页 |
| ·质粒与菌株 | 第131页 |
| ·工具酶与试剂 | 第131页 |
| ·PCR引物 | 第131-132页 |
| ·实验方法 | 第132-135页 |
| ·融合蛋白的分子设计、结构模拟与功能预测 | 第135-145页 |
| ·DAAO空间结构的分子模拟与分析 | 第135-138页 |
| ·GL-7-ACA酰化酶空间结构的分子模拟与分析 | 第138-142页 |
| ·连接肽的设计 | 第142-143页 |
| ·融合蛋白空间结构的分子模拟及功能预测 | 第143-145页 |
| ·融合蛋白基因的构建 | 第145-153页 |
| ·构建策略的建立 | 第145-148页 |
| ·融合蛋白构建策略 | 第148-150页 |
| ·融合蛋白构建策略 | 第150-153页 |
| ·融合蛋白在重组大肠杆菌中的表达机制探讨 | 第153-157页 |
| ·融合蛋白在重组大肠杆菌中表达条件的优化 | 第157-160页 |
| ·最佳诱导菌龄的确定 | 第157页 |
| ·诱导剂IPTG浓度对酶活的影响 | 第157-158页 |
| ·诱导温度对ALD表达的影响 | 第158页 |
| ·乳糖诱导的初步研究 | 第158-160页 |
| ·融合蛋白ALD在大肠杆菌中的表达规律 | 第160页 |
| ·工作展望 | 第160-161页 |
| ·本章小结 | 第161-162页 |
| 第六章 酶法催化头孢菌素C生成7-ACA的工艺研究 | 第162-181页 |
| ·引言 | 第162-163页 |
| ·材料与方法 | 第163-165页 |
| ·菌株 | 第163页 |
| ·试剂 | 第163页 |
| ·中空纤维膜组件 | 第163页 |
| ·实验方法 | 第163-165页 |
| ·催化条件的优化 | 第165-172页 |
| ·温度对酶活的影响 | 第165-166页 |
| ·pH对酶活的影响 | 第166-168页 |
| ·对温度的稳定性 | 第168-169页 |
| ·对pH的稳定性 | 第169-170页 |
| ·DAAO催化头孢菌素C的反应 | 第170-171页 |
| ·GL-7-ACA酰化酶的催化反应 | 第171-172页 |
| ·7-ACA催化反应中双酶的加入比例 | 第172页 |
| ·不同基因工程菌催化CPC的工艺 | 第172-176页 |
| ·混合菌催化CPC | 第173页 |
| ·双酶基因共表达重组菌催化CPC | 第173-174页 |
| ·融合蛋白ALD的重组菌催化CPC | 第174-175页 |
| ·酶在催化过程中的稳定性 | 第175-176页 |
| ·膜分离的应用 | 第176-178页 |
| ·7-ACA的制备 | 第178-179页 |
| ·本章小结 | 第179-181页 |
| 结 论 | 第181-185页 |
| 参考文献 | 第185-195页 |
| 致谢及声明 | 第195-196页 |
| 附 录 | 第196-218页 |
| 附录1 实验仪器及主要药品 | 第196-198页 |
| 附录2 Total RNA 提取方法 | 第198-199页 |
| 附录3 E. coli感受态细胞的制备及质粒转化 | 第199-200页 |
| 附录4 试剂盒法提取质粒 | 第200-201页 |
| 附录5 琼脂糖凝胶电泳 | 第201-202页 |
| 附录6 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段 | 第202-203页 |
| 附录7 三角酵母DAAO基因及对应的氨基酸序列 | 第203-204页 |
| 附录8 GL-7-ACA酰化酶基因及对应的氨基酸序列 | 第204-212页 |
| 附录9 融合蛋白ALD的基因及对应的氨基酸序列 | 第212-215页 |
| 附录10 HPLC分析方法 | 第215-217页 |
| 附录11 菌浓OD600与菌干重的对应关系 | 第217-218页 |
