| 中文摘要 | 第1-8页 |
| 英文摘要 | 第8-12页 |
| 缩略词表 | 第12-15页 |
| 前言 | 第15-18页 |
| 实验材料 | 第18-25页 |
| 1 菌株与质粒 | 第18页 |
| 2 细胞系和实验动物 | 第18页 |
| 3 限制性内切酶及修饰酶 | 第18页 |
| 4 其它主要实验材料 | 第18-21页 |
| 5 主要溶液配制 | 第21-23页 |
| 6 主要仪器 | 第23-25页 |
| 第一部分 重组逆转录病毒载体的构建和鉴定 | 第25-46页 |
| 一、实验方法 | 第25-39页 |
| 1．逆转录病毒介导人PF4及其相关多肽基因靶向实体瘤新生血管的基本路线 | 第25-27页 |
| 2．人PF4及其相关多肽基因逆转录病毒载体的设计与构建 | 第27-39页 |
| 2．1 RT-PCR及PCR扩增人PF4及其相关多肽基因序列 | 第27-30页 |
| 2．2 低熔点胶(LMPA)法回收DNA片段 | 第30页 |
| 2．3 回收的PF4和p17-70 PCR产物的酶切 | 第30-31页 |
| 2．4 逆转录病毒载体的限制性内切酶消化、纯化和回收 | 第31-32页 |
| 2．5 连接反应 | 第32页 |
| 2．6 感受态大肠杆菌细胞制备 | 第32页 |
| 2．7 感受态细胞的转化 | 第32-33页 |
| 2．8 质粒DNA的小量制备 | 第33页 |
| 2．9 目的基因的测序 | 第33-37页 |
| 2．10 质粒DNA的大量制备 | 第37-39页 |
| 二、实验结果 | 第39-46页 |
| 1．表达人PF4基因及p17-70基因的逆转录病毒载体构建 | 第39-42页 |
| 1．1 人PF4基因全长序列的构建 | 第39-40页 |
| 1．2 人PF4相关多肽基因-p17-70的构建 | 第40-41页 |
| 1．3 重组人PF4全长基因及p17-70基因的逆转录病毒载体构建 | 第41-42页 |
| 2 PF4基因和p17-70基因的测序 | 第42-46页 |
| 第二部分 产病毒细胞系的建立和病毒感染受体细胞 | 第46-61页 |
| 一、实验方法 | 第46-54页 |
| 1．细胞培养 | 第46页 |
| 2．细胞传代及冻存 | 第46-47页 |
| 3．细胞复苏 | 第47页 |
| 4．受体细胞的筛选 | 第47-48页 |
| 5．产病毒细胞系的建立 | 第48-52页 |
| 5．1 逆转录病毒重组体转染包装细胞系 | 第49-51页 |
| 5．2 产病毒细胞系的扩增、冻存及病毒上清收集 | 第51-52页 |
| 5．3 病毒滴度的测定 | 第52页 |
| 6．病毒上清感染KB细胞 | 第52-53页 |
| 6．1 收集病毒上清 | 第52页 |
| 6．2 病毒感染KB细胞的程序 | 第52-53页 |
| 7．PCR,RT-PCR和Western印迹分析 | 第53-54页 |
| 7．1 细胞基因组DNA的提取 | 第53页 |
| 7．2 细胞总RNA的提取 | 第53-54页 |
| 7．3 PCR,RT-PCR扩增 | 第54页 |
| 7．4 Western印迹分析 | 第54页 |
| 二、实验结果 | 第54-61页 |
| 1．逆转录病毒的包装、收获及滴度测定 | 第54-57页 |
| 1．1 病毒的包装 | 第54-56页 |
| 1．2 逆转录病毒的收获、滴度测定 | 第56-57页 |
| 2．逆转录病毒体外感染人头颈部癌KB细胞 | 第57-58页 |
| 3．PF4和p17-70基因在PA317细胞和KB细胞中表达的鉴定 | 第58-61页 |
| 第三部分 重组目的基因的体内外功能实验 | 第61-79页 |
| 一 实验方法 | 第61-65页 |
| 1．重组目的基因的体外功能实验 | 第61-64页 |
| 1．1 病毒感染的KB细胞的生长曲线测定 | 第61页 |
| 1．2 MTT法检测感染的KB细胞的增殖指数 | 第61-62页 |
| 1．3 克隆形成率方法检测感染的KB细胞的增长能力 | 第62-63页 |
| 1．4 MTT法检测重组逆转录病毒上清和感染的KB细胞培养液对KB细胞的增殖的作用 | 第63页 |
| 1．5 MTT法检测重组逆转录病毒上清和感染的KB细胞培养液对人脐静脉内皮细胞的增殖的作用 | 第63-64页 |
| 2．重组目的基因的体内功能实验 | 第64-65页 |
| 2．1 建立KB细胞裸鼠移植瘤动物模型 | 第64页 |
| 2．2 免疫组织化学检测血管密度 | 第64页 |
| 2．3 统计学分析 | 第64-65页 |
| 二、实验结果 | 第65-79页 |
| 1．病毒重组体的体外实验结果 | 第65-69页 |
| 1．1 KB细胞的生长曲线 | 第65页 |
| 1．2 KB细胞的克隆形成率 | 第65页 |
| 1．3 病毒上清和感染的KB细胞培养液对KB细胞增殖的作用 | 第65-66页 |
| 1．4 病毒上清和感染的KB细胞培养液对HUVEC增殖的作用 | 第66-69页 |
| 2．病毒重组体的体内实验结果 | 第69-79页 |
| 2．1 裸鼠移植瘤平均生长曲线 | 第69-70页 |
| 2．2 裸鼠移植瘤平均重量 | 第70-74页 |
| 2．3 荷瘤鼠生存曲线 | 第74-75页 |
| 2．4 裸鼠移植瘤血管密度 | 第75-79页 |
| 讨论 | 第79-84页 |
| 小结与结论 | 第84-86页 |
| 参考文献 | 第86-90页 |
| 文献综述 | 第90-127页 |
| 致谢 | 第127-128页 |
| 发表文章 | 第128页 |
