| 中文摘要 | 第1-10页 |
| 英文摘要 | 第10-13页 |
| 前言 | 第13-16页 |
| 材料和方法 | 第16-43页 |
| 实验材料 | 第16-18页 |
| 一、质粒和载体 | 第16页 |
| 二、菌株 | 第16页 |
| 三、cDNA文库 | 第16页 |
| 四、酶制剂及常用试剂盒 | 第16页 |
| 五、引物 | 第16-17页 |
| 六、放射性同位素 | 第17页 |
| 七、实验用组织 | 第17页 |
| 八、免疫试剂 | 第17页 |
| 九、细胞株及细胞培养用品 | 第17-18页 |
| 十、主要化学试剂及材料 | 第18页 |
| 十一、主要仪器 | 第18页 |
| 实验方法 | 第18-43页 |
| 1.差异显示PCR及PCR产物的克隆 | 第18-21页 |
| ·差异显示PCR | 第18页 |
| ·差异PCR产物末端削平 | 第18-19页 |
| ·载体pBlueScript-SKⅡ(+)的线性化处理 | 第19页 |
| ·体外连接反应 | 第19-20页 |
| ·质粒转化 | 第20页 |
| ·重组克隆的筛选和鉴定 | 第20页 |
| ·重组质粒测序模板的提取 | 第20-21页 |
| 2.差异PCR产物(cDNA)测序分析 | 第21页 |
| 3.序列同源性比较 | 第21页 |
| 4.cDNA文库的PCR及杂交筛选 | 第21-23页 |
| ·点阵cDNA文库的制备和筛选策略 | 第21-22页 |
| ·PCR筛选点阵cDNA文库 | 第22页 |
| ·阳性噬菌斑的杂交筛选 | 第22-23页 |
| ·阳性克隆的纯化 | 第23页 |
| 5.λDR2噬菌体环化为质粒pDR2 | 第23-24页 |
| ·宿主细菌的制备 | 第23页 |
| ·环化 | 第23-24页 |
| 6.阳性克隆的鉴定及序列测定 | 第24页 |
| 7.DNA序列和蛋白序列的软件分析 | 第24页 |
| 8.细胞总RNA的提取 | 第24-25页 |
| ·超速离心的方法提取胎脑组织总RNA | 第24-25页 |
| ·主要试剂 | 第24页 |
| ·具体实验步骤 | 第24-25页 |
| ·以Trizol试剂提取细胞的总RNA | 第25页 |
| 9.胎脑组织及成人多组织Northern杂交 | 第25-26页 |
| ·转膜 | 第25-26页 |
| ·Northern杂交 | 第26页 |
| ·成人多组织Northern杂交 | 第26页 |
| ·胎脑组织总RNA杂交 | 第26页 |
| 10.人的类硫氧化还原蛋白基因(hTRXL)的原核表达与纯化 | 第26-31页 |
| ·PCR扩增目的片段 | 第26-28页 |
| ·pET28载体的去磷酸化处理 | 第28页 |
| ·DNA的酶切、连接、测序 | 第28-29页 |
| ·重组蛋白的检测及SDS—PAGE电泳 | 第29页 |
| ·可溶性蛋白的纯化 | 第29-30页 |
| ·缓冲液 | 第29-30页 |
| ·树脂的准备 | 第30页 |
| ·细胞抽提物的制备 | 第30页 |
| ·柱层析 | 第30页 |
| ·不可溶蛋白在变性条件下的纯化 | 第30-31页 |
| 11.胰岛素还原实验 | 第31-32页 |
| ·重组蛋白的脱盐纯化 | 第31页 |
| ·胰岛素还原实验 | 第31-32页 |
| 12.TRXL在多种淋巴瘤细胞中的表达及它对细胞生长的作用 | 第32页 |
| ·细胞培养的条件 | 第32页 |
| ·TRXL在多种淋巴瘤细胞中表达的检测 | 第32页 |
| ·TRXL对细胞生长的作用 | 第32页 |
| 13.细胞转染 | 第32-34页 |
| ·真核表达质粒的构建和提取 | 第32页 |
| ·MCF-7细胞的瞬时转染 | 第32-33页 |
| ·MCF-7细胞的稳定转染 | 第33页 |
| ·稳定转染的细胞克隆的细胞凋亡分析 | 第33-34页 |
| ·细胞凋亡的诱导 | 第33-34页 |
| ·凋亡细胞的碘化丙啶(PI)排斥分析法 | 第34页 |
| 14.筛选得到的细胞克隆的hTRXL整合和表达分析 | 第34-36页 |
| ·Southern blot分析外源hTRXL的整合 | 第34-36页 |
| ·DNA样品的酶解 | 第34页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳 | 第34-35页 |
| ·Southern印迹 | 第35页 |
| ·预杂交 | 第35-36页 |
| ·随机引物法标记DNA探针 | 第36页 |
| ·杂交 | 第36页 |
| ·洗膜和放射自显影 | 第36页 |
| ·稳定整合的细胞克隆中hTRXL表达的Northern检测 | 第36页 |
| 15.多克隆抗体的制备 | 第36-39页 |
| ·免疫抗原的准备 | 第36页 |
| ·免疫动物 | 第36-37页 |
| ·动物放血 | 第37-38页 |
| ·器械 | 第37页 |
| ·颈动脉放血 | 第37-38页 |
| ·酶联免疫吸附实验(ELISA) | 第38-39页 |
| ·试剂 | 第38页 |
| ·实验步骤 | 第38-39页 |
| 16.Western杂交 | 第39-41页 |
| ·Western-blot杂交用液 | 第39页 |
| ·细胞总蛋白提取用液 | 第39页 |
| ·细胞总溶解蛋白提取 | 第39-40页 |
| ·福林(Folin)-酚法测定蛋白质含量(Lowry法) | 第40页 |
| ·Western-Blot蛋白印迹杂交 | 第40-41页 |
| ·SDS-PAGE电泳以及考马斯亮蓝染色 | 第40页 |
| ·转膜 | 第40-41页 |
| ·抗原抗体反应及显色反应 | 第41页 |
| 17.免疫组织化学杂交 | 第41-43页 |
| ·细胞的处理 | 第41页 |
| ·杂交用液 | 第41-42页 |
| ·免疫组化杂交 | 第42-43页 |
| 实验结果(一) hTRXL的克隆、鉴定和功能分析 | 第43-72页 |
| 一、mRNA差异显示分析和具有差异表达特征的EST的克隆 | 第43页 |
| 二、人的类硫氧化还原蛋白全长cDNA的筛选 | 第43-45页 |
| 1.EST HFBEST12的分析 | 第43页 |
| 2.人的类硫氧化还原蛋白基因(hTRXL)全长cDNA克隆的筛选 | 第43-45页 |
| 三、人的类硫氧化还原蛋白(hTRXL)全长cDNA的序列测定和分析 | 第45-51页 |
| 1.亚克隆及序列测定 | 第45-46页 |
| 2.序列分析 | 第46-51页 |
| 四、hTRXL的组织表达谱 | 第51-52页 |
| 五、TRXL的原核表达和蛋白纯化 | 第52-59页 |
| 1.pET28b-TRXL的重组质粒的构建 | 第52-54页 |
| 2.TRXL不同区段原核表达克隆的构建 | 第54页 |
| 3.重组质粒在Ecoli中的表达及纯化 | 第54-59页 |
| 六、人的类硫氧化还原蛋白(TRXL)的还原活性检测 | 第59-62页 |
| 1.反应原理 | 第59-60页 |
| 2.重组蛋白的纯化 | 第60页 |
| 3.还原实验 | 第60-62页 |
| 七、hTRXL在多种淋巴瘤细胞中的表达及它对细胞生长的作用 | 第62-64页 |
| 1.hTRXL在多种淋巴瘤细胞中的表达的检测 | 第62-63页 |
| 2.hTRXL对细胞生长的作用 | 第63-64页 |
| 八、pEGFP-TRXL重组质粒真核细胞瞬时表达克隆的构建和真核细胞转染 | 第64-67页 |
| 1.质粒pEGFP-TRXL的构建 | 第64-65页 |
| 2.重组质粒pEGFP-TRXL的真核细胞转染 | 第65-67页 |
| 九.真核表达质粒pCDNA 3.1／Zeo-TRXL稳定表达克隆的筛选 | 第67-72页 |
| 1.pcDNA3.1／Zeo-TRXL重组质粒的构建 | 第67页 |
| 2.稳定表达克隆的筛选和整合克隆的Southern鉴定 | 第67-68页 |
| 3.稳定整合的细胞克隆中hTRXL表达的Northern检测 | 第68-69页 |
| 4.稳定转染的细胞克隆的细胞凋亡分析 | 第69-72页 |
| 讨论(一) hTRXL的克隆、鉴定和功能分析 | 第72-78页 |
| 一、类硫氧化还原蛋白(TRXL)与硫氧化还原蛋白(TRX)家族其它成员序列结构上的不同 | 第72-73页 |
| 二、类硫氧化还原蛋白和硫氧化还原蛋白家族的关联和不同 | 第73-74页 |
| 三、与类硫氧化还原蛋白相关的其它蛋白 | 第74-75页 |
| 四、类硫氧化还原蛋白的可能功能推测 | 第75-78页 |
| 实验结果(二) 钙周期素结合蛋白基因的克隆和初步功能研究 | 第78-90页 |
| 一、人的钙周期素结合蛋白基因全长cDNA克隆的筛选 | 第78-81页 |
| 1.全长cDNA克隆的获得 | 第78-80页 |
| 2.cDNA编码序列的特征分析 | 第80-81页 |
| 二、人的钙周期素结合蛋白基因(CacyBP)的原核表达和蛋白纯化 | 第81-85页 |
| 1.pET28c-CacyBP的重组质粒的构建 | 第81-83页 |
| 2.pET28c-CacyBP重组质粒在Ecoli中的表达及纯化 | 第83-85页 |
| 三、CacyBP的Northern Blot分析 | 第85页 |
| 四、基因组DNA的Southern杂交 | 第85-86页 |
| 五、人的钙周期素结合蛋白的Western Blot杂交结果 | 第86-87页 |
| 六、BT325细胞的免疫组织化学杂交结果 | 第87-90页 |
| 讨论(二) 钙周期素结合蛋白基因的克隆和初步功能研究 | 第90-93页 |
| 小结 | 第93-95页 |
| 参考文献 | 第95-100页 |
| 论文综述 | 第100-108页 |
| 附录Ⅰ、英、汉名词对照 | 第108-109页 |
| 附录Ⅱ、对本文所克隆基因命名的说明 | 第109-110页 |
| 致谢 | 第110页 |
