| 前言 | 第1-11页 |
| 英文缩写词表 | 第11-15页 |
| 中文摘要 | 第15-19页 |
| 英文摘要 | 第19-24页 |
| 文献综述 | 第24-65页 |
| 抗体的基因工程及其研究进展 | 第24-65页 |
| 一、抗体的分子构型及基因重(?) | 第25-27页 |
| 二、基因工程抗体及其种类 | 第27-41页 |
| (一) 基因工程抗体 | 第27-28页 |
| (二) 几种常见的基因工程抗体的种类 | 第28-41页 |
| 1.嵌合抗体 | 第28-30页 |
| 2.重构型抗体 | 第30-31页 |
| 3.双功能抗体 | 第31-33页 |
| 4.小分子抗体(抗体功能性片段) | 第33-39页 |
| 5.抗独特型和自身抗体的基因工程抗体 | 第39-41页 |
| 三、全套抗体噬菌体表面呈现技术及其应用 | 第41-54页 |
| (一) 发展简史 | 第41页 |
| (二) 噬菌体抗体库的构建及Panning筛选 | 第41-45页 |
| 1.目的抗体基因的获得 | 第42-43页 |
| 2.抗体基因的拼接 | 第43页 |
| 3.抗体基因与载体的重组 | 第43-44页 |
| 4.重组子的转化及Panning | 第44-45页 |
| (三) 抗体的融合型表达及分泌型表达 | 第45-46页 |
| (四) 噬菌体抗体库技术的特点 | 第46-49页 |
| 1.模拟天然抗体库 | 第46-48页 |
| 2.绕过杂交瘤与免疫技术 | 第48页 |
| 3.可获得人源性抗体及转换鼠源性抗体 | 第48-49页 |
| (五) 噬菌体抗体库技术的应用 | 第49-54页 |
| 1.增加库容 | 第49-50页 |
| 2.模拟体内亲和力成熟 | 第50-51页 |
| 3.半人工合成抗体文库 | 第51-52页 |
| 4.抗微生物噬菌体抗体的研究 | 第52-54页 |
| 四、基因工程抗体的表达 | 第54-61页 |
| (一) 原核表达 | 第54-55页 |
| (二) 真核表达 | 第55-56页 |
| (三) 植物表达 | 第56-57页 |
| (四) 真核细胞内表达 | 第57-59页 |
| (五) 机体内表达 | 第59-61页 |
| 五、抗肾综合症出血热病毒的基因工程抗体的研究 | 第61-62页 |
| 六、基因工程抗体研究的一些策略与展望 | 第62-65页 |
| (一) 几种策略或建议 | 第62-64页 |
| 1.关于目的基因的获得 | 第62-63页 |
| 2.外源性目的基因与载体的重组 | 第63页 |
| 3.表达方式的选择 | 第63-64页 |
| (二) 对未来研究趋势的几点展望 | 第64-65页 |
| 1.向大片段以至全抗体分子方向发展 | 第64页 |
| 2.人源性高亲和力临床应用型抗体 | 第64页 |
| 3.高效、低毒的表达系统的建立 | 第64-65页 |
| 毕业论文： | 第65-105页 |
| 人源性全套噬菌体抗体库的构建以及抗汉坦病毒抗体的筛选与表达 | 第65-105页 |
| 材料与方法 | 第67-83页 |
| 一、hPBLs总RNA的分离及cDNA第一链合成 | 第67-68页 |
| (一) hPBLs分离 | 第67页 |
| (二) 总RNA的分离及cDNA第一链合成 | 第67-68页 |
| 二、人抗体V区基因的扩增及扩增产物的回收、纯化 | 第68-71页 |
| (一) 引物的设计与合成 | 第68-69页 |
| (二) PCR方法及其产物的回收纯化 | 第69-71页 |
| 1.自合成的cDNA第一链扩增 | 第69-70页 |
| 2.自hPBLs扩增—细胞内RT—PCR(RT—PCR in cells) | 第70页 |
| 3.各PCR产物的回收、纯化 | 第70-71页 |
| 三、抗体V区基因的拼接及扩增、纯化 | 第71-73页 |
| (一) linker模板及引物的设计与linker扩增 | 第71-73页 |
| 1.linker模板及引物的设计 | 第71-72页 |
| 2.linker扩增 | 第72-73页 |
| (二) SOE反应 | 第73页 |
| 四、ScFv、V_H与载体的重组 | 第73-76页 |
| (一) 载体pHEN_1的制备及鉴定 | 第73-75页 |
| (二) pHEN_1的双酶切及鉴定 | 第75页 |
| (三) 外源基因的进一步扩增、纯化及双酶切反应 | 第75页 |
| (四) 连接(重组)反应 | 第75-76页 |
| 五、库(repertoire of antibodies displayed on phage)的获得 | 第76-78页 |
| (一) 感受态细菌的制备 | 第76页 |
| (二) 重组子向感受态TG_1的转化 | 第76-77页 |
| (三) M13KO7的制备 | 第77-78页 |
| (四) 初级文库的获得 | 第78页 |
| 六、文库的panning筛选 | 第78-79页 |
| (一) 抗原的固相化 | 第78页 |
| (二) 吸附 | 第78页 |
| (三) 再转染 | 第78页 |
| (四) 超感染 | 第78-79页 |
| (五) 次级库的获得 | 第79页 |
| 七、单个克隆的产生及克隆抗体活性测定 | 第79-80页 |
| 八、阳性克隆外源基因序列的测定 | 第80页 |
| (一) 测序模板的制备 | 第80页 |
| (二) 测序引物的设计 | 第80页 |
| (三) 测序方法 | 第80页 |
| 九、抗EHF抗体的分泌型表达 | 第80-83页 |
| 结果 | 第83-96页 |
| 一、出血热恢复期病人全套抗体V_H和V_L基因的扩增 | 第83-85页 |
| (一) hPBLs分离、RNA提取及cDNA第一链合成 | 第83页 |
| (二) 人全套抗体VH和VL的扩增 | 第83-85页 |
| 1.以cDNA第一链为模板的扩增 | 第84-85页 |
| 2.细胞内RT—PCR直接扩增 | 第85页 |
| 二、抗体V区基因的拼接及扩增、纯化 | 第85-86页 |
| (一) linker的扩增 | 第85-86页 |
| (二) SOE反应 | 第86页 |
| 三、ScFv、V_H的克隆及文库的构建 | 第86-88页 |
| 四、文库的Panning筛选 | 第88页 |
| 五、单个克隆融合表达产物活性的ELISA鉴定 | 第88-90页 |
| 六、ScFv、V_H阳性克隆的测序分析 | 第90-95页 |
| 七、抗EHF抗体的分泌型表达 | 第95-96页 |
| 讨论 | 第96-103页 |
| 一、人源性全套噬菌体抗体库的构建及筛选方面某些问题的探讨 | 第97-102页 |
| (一) 关于建库的几个问题 | 第97-100页 |
| (二) 文库的panning筛选 | 第100-101页 |
| (三) 关于“bypassing immunization”的讨论 | 第101-102页 |
| 二、抗HTV基因工程抗体的研究 | 第102-103页 |
| 小结 | 第103-105页 |
| 参考文献 | 第105-123页 |
| 附录 | 第123-144页 |
| Ⅰ.抗体工程研究中几点思维启示和策略 | 第123-133页 |
| Ⅱ.从人外周血淋巴细胞扩增抗体V区基因的三种方法 | 第133-143页 |
| Ⅲ.在读期间发表论著一览 | 第143-144页 |
| 后记与致谢 | 第144页 |
