| 目录 | 第1-10页 |
| 图表目录 | 第10-13页 |
| 英文略语表 | 第13-16页 |
| 中文摘要 | 第16-19页 |
| 英文摘要 | 第19-22页 |
| 第一部分 PAMAM纳米材料毒性的研究 | 第22-61页 |
| 前言 | 第22-26页 |
| 参考文献 | 第26-28页 |
| 第一节 PAMAM G3通过AKT-TSC2-mTOR引起A549细胞自噬性死亡,以及导致小鼠急性肺损伤 | 第28-48页 |
| 1 实验材料 | 第28-30页 |
| ·细胞 | 第28页 |
| ·质粒 | 第28页 |
| ·实验动物 | 第28页 |
| ·纳米材料 | 第28页 |
| ·细胞培养用耗材 | 第28页 |
| ·实验试剂 | 第28-29页 |
| ·抗体 | 第28-29页 |
| ·试剂盒 | 第29页 |
| ·siRNA | 第29页 |
| ·实验药物及试剂 | 第29页 |
| ·实验设备 | 第29-30页 |
| 2 实验方法 | 第30-36页 |
| ·PAMAM纳米材料的处理 | 第30页 |
| ·MTT方法测定PAMAM纳米材料对细胞活性的影响 | 第30页 |
| ·细胞DNA基因组提取 | 第30-31页 |
| ·Caspase-3活性测定 | 第31页 |
| ·PAMAM G3导致A549细胞产生自噬的电镜实验 | 第31-32页 |
| ·PAMAM G3引起转染EGFP-LC3的A549细胞EGFP-LC3凝集实验 | 第32页 |
| ·Western blotting检测PAMAM G3引起的A549细胞信号通路蛋白表达水平的变化 | 第32-33页 |
| ·用RNAi技术干扰A549细胞的TSC2基因表达,统计经PAMAM G3处理的转染有EGFP-LC3的A549中EGFP-LC3的聚集实验 | 第33页 |
| ·用RNAi技术干扰A549细胞的TSC2基因表达,加入PAMAM G3后测定A549细胞活性 | 第33-34页 |
| ·用RNAi技术干扰A549细胞的ATG6基因表达,加入PAMAM G3后测定A549细胞活性 | 第34页 |
| ·小鼠肺部病理切片检查 | 第34页 |
| ·小鼠肺干湿比 | 第34-35页 |
| ·小鼠肺弹性变化测定 | 第35页 |
| ·小鼠死亡率测定 | 第35-36页 |
| 3 实验结果 | 第36-47页 |
| ·PAMAM纳米材料对A549细胞增值影响的MTT实验 | 第36页 |
| ·PAMAM G3不会引起A549细胞凋亡 | 第36-37页 |
| ·PAMAM G3不激活A549细胞中caspase-3的活性 | 第37页 |
| ·PAMAM G3引起A549细胞发生自噬:电镜分析 | 第37-38页 |
| ·PAMAM G3引起A549细胞发生自噬:EGFP-LC3聚集的激光共聚焦分析 | 第38-39页 |
| ·PAMAM G3引起A549细胞自噬:上调LC3-Ⅱ | 第39页 |
| ·自噬抑制剂3MA改善PAMAM G3引起的自噬性细胞死亡 | 第39-40页 |
| ·ATG6 siRNA改善PAMAM G3引起的自噬性细胞死亡 | 第40页 |
| ·PAMAM G4、G5、G6、G7和G8引起A549细胞自噬:上调LC3-Ⅱ | 第40-41页 |
| ·3MA改善PAMAM G4、G5、G6、G7和G8引起的A549细胞死亡 | 第41-42页 |
| ·PAMAM G3下调磷酸化mTOR/总mTOR的比值 | 第42页 |
| ·PAMAM G3下调磷酸化S6/总S6的比值 | 第42页 |
| ·A549细胞经TSC2 siRNA转染后,PAMAM G3引起的细胞自噬阳性率降低 | 第42-43页 |
| ·A549细胞经TSC2 siRNA转染后,改善PAMAM G3引起的细胞死亡 | 第43-44页 |
| ·PAMAM G3下调磷酸化AKT/总AKT的比值 | 第44页 |
| ·PAMAM G3引起A549自噬性细胞死亡的信号通路模式图 | 第44-45页 |
| ·PAMAM G3引起Balb/c/小鼠急性肺损伤 | 第45页 |
| ·PAMAM G3引起Balb/c/小鼠肺水肿 | 第45-46页 |
| ·PAMAM G3引起Balb/c小鼠肺弹性的变化 | 第46页 |
| ·3MA改善PAMAM G3导致的Baib/c小鼠死亡 | 第46-47页 |
| 小结 | 第47-48页 |
| 第二节 PAMAM G5激活肾素-血管紧张素系统 | 第48-52页 |
| 1 实验材料 | 第48页 |
| ·实验动物 | 第48页 |
| ·纳米材料 | 第48页 |
| ·实验试剂 | 第48页 |
| ·实验设备 | 第48页 |
| 2 实验方法 | 第48-50页 |
| ·PAMAM纳米材料的处理 | 第48页 |
| ·小鼠血浆AngⅡ的测定 | 第48-50页 |
| 3 实验结果 | 第50-51页 |
| ·PAMAM G5引起小鼠血浆Ang Ⅱ的升高 | 第50页 |
| ·洛沙坦可以改善PAMAM G5 引起的小鼠血浆Ang Ⅱ升高 | 第50-51页 |
| 小结 | 第51-52页 |
| 第三节 PAMAM G7引起人外周血单核细胞以及小鼠肺巨噬细胞分泌炎性细胞因子 | 第52-61页 |
| 1 实验材料 | 第52页 |
| ·实验动物 | 第52页 |
| ·纳米材料 | 第52页 |
| ·实验试剂 | 第52页 |
| ·实验设备 | 第52页 |
| 2 实验方法 | 第52-55页 |
| ·PAMAM纳米材料的处理 | 第52页 |
| ·人外周血单核细胞分离 | 第52-53页 |
| ·小鼠肺灌洗 | 第53页 |
| ·ELISA测定细胞因子 | 第53-55页 |
| 3 实验结果 | 第55-60页 |
| ·PAMAM G5、G6、G7和G8引起人外周血单核细胞分泌TNF-α | 第55页 |
| ·PAMAM G5、G6、G7和G8引起人外周血单核细胞分泌IL-1β | 第55-56页 |
| ·PAMAM G5、G6、G7和G8引起人外周血单核细胞IL-6 | 第56页 |
| ·PAMAM G7引起人外周血单核细胞分泌TNF-α | 第56-57页 |
| ·PAMAM G7引起人外周血单核细胞分泌IL-1β | 第57页 |
| ·PAMAM G7引起人外周血单核细胞分泌IL-6 | 第57-58页 |
| ·PAMAM G7引起小鼠肺部巨噬细胞分泌TNF-α | 第58页 |
| ·PAMAM G7引起小鼠肺部巨噬细胞分泌IL-1β | 第58-59页 |
| ·PAMAM G7引起小鼠肺部巨噬细胞分泌IL-6 | 第59-60页 |
| 小结 | 第60-61页 |
| 第二部分 碳纳米管对A549细胞毒性的研究 | 第61-82页 |
| 前言 | 第61-63页 |
| 参考文献 | 第63-64页 |
| 第一节 单壁碳纳米管引起A549细胞自噬的研究 | 第64-74页 |
| 1 实验材料 | 第64-65页 |
| ·细胞 | 第64页 |
| ·单壁碳纳米管 | 第64页 |
| ·细胞培养用耗材 | 第64页 |
| ·实验试剂 | 第64-65页 |
| ·抗体 | 第64页 |
| ·试剂盒 | 第64-65页 |
| ·实验药物及试剂 | 第65页 |
| ·实验设备 | 第65页 |
| 2 实验方法 | 第65-68页 |
| ·单壁碳纳米管材料溶液的配制 | 第65页 |
| ·MTT方法测定单壁碳纳米管对细胞活性的影响 | 第65-66页 |
| ·经碳纳米管处理的A549细胞电镜样品制备 | 第66-67页 |
| ·Western blotting检测碳纳米管引起的A549细胞信号通路蛋白表达水平的变化 | 第67-68页 |
| 3 实验结果 | 第68-73页 |
| ·Amide和COOH单壁碳管引起A549细胞自噬小体增加 | 第68-69页 |
| ·Amide和COOH单壁碳管上调A549 LC3-Ⅱ | 第69-70页 |
| ·Amide和COOH单壁碳管下调A549细胞中磷酸化mTOR/总mTOR | 第70页 |
| ·Amide和COOH单壁碳管下调A549细胞磷酸化AKT/总AKT | 第70-71页 |
| ·3MA对COOH单壁碳管引起的A549细胞死亡有改善作用 | 第71-73页 |
| 小结 | 第73-74页 |
| 第二节 多壁碳管引起A549细胞凋亡的研究 | 第74-82页 |
| 1 实验材料 | 第74-75页 |
| ·细胞 | 第74页 |
| ·多壁碳纳米管 | 第74页 |
| ·细胞培养用耗材 | 第74页 |
| ·实验试剂 | 第74页 |
| ·实验设备 | 第74-75页 |
| 2 实验方法 | 第75-78页 |
| ·多壁碳纳米管溶液的配制 | 第75页 |
| ·MTT方法测定单壁碳纳米管对细胞活性的影响 | 第75页 |
| ·多壁碳纳米管处理的A549细胞的电镜样品制备 | 第75-76页 |
| ·细胞凋亡的流式分析 | 第76页 |
| ·Caspase-3活性测定 | 第76-78页 |
| 3 实验结果 | 第78-82页 |
| ·多壁碳管引起A549细胞死亡的MTT检测 | 第78页 |
| ·多壁碳管处理的A549电镜图 | 第78页 |
| ·多壁碳管引起A549凋亡的细胞流式检测 | 第78-79页 |
| ·多壁碳管引起的A549凋亡不经过激活caspase-3 | 第79-80页 |
| ·Caspase-3抑制剂Z-VAD-fmk对多壁碳管引起的A549细胞凋亡没有抑制作用 | 第80-82页 |
| 第三部分 SARS-CoV刺突蛋白引起内质网应激干扰胰岛素信号通路 | 第82-96页 |
| 前言 | 第82-84页 |
| 参考文献 | 第84-86页 |
| 1 实验材料 | 第86-88页 |
| ·细胞 | 第86页 |
| ·质粒 | 第86页 |
| ·工具酶、酶切缓冲液及DNA Marker | 第86页 |
| ·主要化学试剂 | 第86页 |
| ·细胞培养用耗材 | 第86-87页 |
| ·实验试剂 | 第87页 |
| ·抗体 | 第87页 |
| ·试剂盒 | 第87页 |
| ·实验药物 | 第87页 |
| ·实验动物 | 第87页 |
| ·实验设备 | 第87-88页 |
| 2 实验方法 | 第88-90页 |
| ·S1190-Fc对C57BL/6小鼠血糖影响的研究 | 第88页 |
| ·S1190-Fc对C57BL/6小鼠葡萄糖耐量影响的研究 | 第88页 |
| ·S1190-Fc对C57BL/6小鼠胰岛素耐量影响的研究 | 第88-89页 |
| ·氧化酶法测定葡萄糖含量 | 第89页 |
| ·表达刺突蛋白的质粒转染HEK 293T细胞 | 第89-90页 |
| 3 实验结果 | 第90-95页 |
| ·S1190-Fc对C57BL/6小鼠血糖影响的研究 | 第90页 |
| ·S1190-Fc对C57BL/6小鼠葡萄糖耐量影响的研究 | 第90-91页 |
| ·S1190-Fc对C57BL/6小鼠胰岛素耐量影响的研究 | 第91页 |
| ·Nhe1和Bam H1酶切P13cd5L Fc、P13cd5L S2-Fc和P13cd5L S1190-Fc的电泳图 | 第91-92页 |
| ·检测P13cd5L Fc、P13cd5L S2-Fc和P13cd5L S1190-Fc在HEK 293T细胞中的转染表达 | 第92页 |
| ·P13cd5L S2-Fc和P13cd5L S1190-Fc表达引起HEK 293T 细胞内质网应激:上调GRP78 | 第92-93页 |
| ·P13cd5L S2-Fc和P13cd5L S1190-Fc表达引起HEK 293T 细胞内质网应激:上调GRP94 | 第93页 |
| ·P13cd5L S2-Fc和P13cd5L S1190-Fc表达干扰胰岛素信号通路 | 第93-94页 |
| ·P13cd5L S2-Fc和P13cd5L S1190-Fc表达干扰胰岛素信号通路 | 第94-95页 |
| 小结 | 第95-96页 |
| 第四部分 SARS冠状病毒刺突蛋白的免疫学研究以及内毒素的去除 | 第96-114页 |
| 前言 | 第96-99页 |
| 参考文献 | 第99-100页 |
| 1 实验材料 | 第100-101页 |
| ·细胞培养 | 第100页 |
| ·细胞培养用耗材 | 第100页 |
| ·ELISA试剂盒 | 第100页 |
| ·TEV蛋白酶切 | 第100页 |
| ·内毒素检测及去除 | 第100页 |
| ·内毒素检测试剂 | 第100页 |
| ·内毒素去除柱 | 第100页 |
| ·淋巴细胞分离 | 第100-101页 |
| ·主要仪器及设备 | 第101页 |
| 2 实验方法 | 第101-106页 |
| ·蛋白提纯 | 第101-102页 |
| ·蛋白中内毒素去除 | 第102页 |
| ·鲎试剂检测内毒素 | 第102页 |
| ·TEV蛋白酶切 | 第102-103页 |
| ·Western blotting检测方法 | 第103-104页 |
| ·淋巴细胞分离 | 第104页 |
| ·人外周血单核细胞分离 | 第104页 |
| ·T细胞分离 | 第104页 |
| ·ELISA测定细胞因子 | 第104-106页 |
| 3 实验结果 | 第106-113页 |
| ·TEV蛋白酶切S1190-Fc | 第106-107页 |
| ·S1190-Tev-Fc蛋白酶切的考马斯亮蓝染色图: | 第106页 |
| ·S1190-Fc蛋白酶切的western blotting图: | 第106-107页 |
| ·S1190引起人外周血单核细胞炎性细胞因子分泌 | 第107-109页 |
| ·S1190引起人外周血单核细胞分泌IFN-γ | 第107页 |
| ·S1190引起人外周血单核细胞分泌TNF-α | 第107-108页 |
| ·S1190引起人外周血单核细胞分泌IL-1β | 第108页 |
| ·S1190引起人外周血单核细胞分泌IL-6 | 第108-109页 |
| ·刺突蛋白中内毒素的去除 | 第109-110页 |
| ·刺突蛋白中内毒素的含量测定 | 第109页 |
| ·刺突蛋白中内毒素的去除 | 第109-110页 |
| ·流经内毒素去除柱后S1190-Fc蛋白性质的测定 | 第110-111页 |
| ·对经过内毒素去除柱的刺突蛋白进行考马斯亮蓝染色检测 | 第110页 |
| ·对经过内毒素去除柱的刺突蛋白进行western blotting检测 | 第110-111页 |
| ·去除内毒素后的S1190蛋白引起人外周血单核细胞细胞因子分泌 | 第111-113页 |
| ·去除内毒素后的S1190引起人外周血单核细胞TNF-α的分泌 | 第111页 |
| ·S1190引起人外周血单核细胞IL-1β的分泌 | 第111-112页 |
| ·S1190引起人外周血单核细胞IL-6的分泌 | 第112-113页 |
| 小结 | 第113-114页 |
| 第五部分 SARS-CoV刺突蛋白突变体的质粒构建及表达纯化 | 第114-136页 |
| 前言 | 第114-116页 |
| 参考文献 | 第116-117页 |
| 1 实验材料 | 第117-122页 |
| ·质粒 | 第117页 |
| ·菌株 | 第117页 |
| ·工具酶、酶切缓冲液及DNA Marker | 第117页 |
| ·主要化学试剂 | 第117-118页 |
| ·细胞培养用耗材 | 第118页 |
| ·试剂盒 | 第118页 |
| ·主要仪器及设备 | 第118-119页 |
| ·主要溶液配方 | 第119-121页 |
| ·E.coli用培养基的配制 | 第119页 |
| ·制备感受态细胞相关溶液 | 第119页 |
| ·抗生素的配制 | 第119页 |
| ·大量提取质粒DNA的相关溶液 | 第119-120页 |
| ·DNA琼脂糖凝胶电泳缓冲液及凝胶的配制 | 第120页 |
| ·细胞冻存液的配制 | 第120页 |
| ·细胞裂解液的配制 | 第120页 |
| ·蛋白质电泳及检测缓冲液 | 第120页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液的配制 | 第120-121页 |
| ·常用缓冲液的配制 | 第121页 |
| ·突变引物 | 第121-122页 |
| 1 实验方法 | 第122-131页 |
| ·PCR扩增 | 第122页 |
| ·末端钝化 | 第122页 |
| ·连接 | 第122-123页 |
| ·转化 | 第123页 |
| ·鉴定 | 第123-124页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第124页 |
| ·质粒DNA的小提 | 第124-125页 |
| ·质粒DNA的大量提取 | 第125-126页 |
| ·重组质粒DNA浓度的测定 | 第126页 |
| ·DNA的纯化回收 | 第126页 |
| ·贴壁细胞培养 | 第126-127页 |
| ·稳定表达细胞株的构建 | 第127页 |
| ·细胞冻存 | 第127页 |
| ·细胞复苏 | 第127-128页 |
| ·细胞裂解 | 第128页 |
| ·ELISA检测方法 | 第128-129页 |
| ·Western blotting的检测方法 | 第129-130页 |
| ·蛋白提纯 | 第130-131页 |
| 2 实验结果 | 第131-136页 |
| ·经PCR,产生突变的puc18-SII | 第131页 |
| ·PCR产物末端钝化,自身连接,转化,小提并测序 | 第131-132页 |
| ·构建突变蛋白表达质粒 | 第132页 |
| ·瞬时转染细胞,检测蛋白的表达 | 第132页 |
| ·质粒大提 | 第132-133页 |
| ·构建稳定表达细胞株 | 第133页 |
| ·质粒线性化并回收线性化的DNA | 第133页 |
| ·将线性化的质粒转染细胞,构建稳定表达细胞株 | 第133页 |
| ·检测融合蛋白的正确表达,并测定表达量 | 第133-134页 |
| ·蛋白提纯 | 第134-136页 |
| 综述一 | 第136-146页 |
| 参考文献 | 第141-146页 |
| 综述二 | 第146-154页 |
| 参考文献 | 第152-154页 |
| 个人简历 | 第154-156页 |
| 致谢 | 第156-158页 |
